Проточный электролизер: Электролизные установки проточного типа — «РУТТЕX»

Электролизные установки проточного типа — «РУТТЕX»

Приготовление концентрированного солевого раствора.

Приготовление концентрированного солевого раствора (рассола) осуществляется при прохождении воды через соляную загрузку, в результате чего образуется 25-30% соляной раствор, который затем подается насосом-дозатором в электролизер. В установках непрерывного действия используем  солерастворители проточного типа, изготовленные из полипропилена,  с полной обвязкой клапанами, устройством контроля перелива и донным фильтром. Необходимо периодически добавлять соль.

Приготовление рабочего раствора.

Рабочий раствор с необходимой концентрацией по NaCl образуется в тройнике непосредственно перед входом в электролизер путем подачи через насос-дозатор концентрированного рассола и воды через ротаметр в строго определенной пропорции.

Получение раствора гипохлорита натрия.

Происходит в электролизере путем прохождения солевого раствора заданной концентрации через набор биполярных электродов, помещенных в пластмассовый корпус.

• Электроды выполнены из титана марки ВТ1-0,ВТ1-00 толщиной 1 мм, покрытие — оксиды платиновой группы.
• Токоподводы, шпильки, шайбы, гайки из титана марки ВТ1-0,ВТ1- 00, покрытие — оксиды платиновой группы.
• Срок службы покрытия — до 5 лет в зависимости от вида и плотности покрытия.
• Покрытие на анодах восстанавливаем. Срок службы электролизера при соблюдении условий эксплуатации и своевременном перепокрытии электродов – от 10 лет и выше.

Очистка электролизера от солей жесткости.

   При использовании неумягченной воды при электролизе на катодах идет осаждение солей Mg  и Ca, присутствующих в воде. Соли забивают межэлектродное пространство, при этом растет напряжение, падает ток электролиза, уменьшается содержание активного хлора в гипохлорите. Для предотвращения образования солей жесткости некоторые производители применяют ионнообменные установки или декарбонизаторы, а также соль марки «ЭКСТРА», что ведет к увеличению комплектации установки, ее габаритов, стоимости, усложняет обслуживание.  Некоторые производители помимо удаления из воды солей жесткости, полируют катоды. Однако это ведет только к незначительному увеличению интервалов между промывками.

   Мы в своих установках серии УЭ ГПХН Сэ предлагаем использование реверса для очистки электродов. Применение нового покрытия из оксидов платиновой группы дает стойкость анодов при реверсе, они не теряют драгметаллы, как это происходит с анодами ОРТА или ОРТА-И:

— Покрытие и анода и катода ведет к увеличению в 2 раза срока службы электродного блока,

— К возможности восстановления покрытия многократно без потери свойств: покрытая катодная часть не впитывает водород и не становится хрупкой.

— Упрощается схема электролиза: отсутствуют декарбонизаторы и ионнообменные установки, емкости и насосы для кислотной промывки.

— Упрощается обслуживание установки.

   Реверс (смена полярности). При электролизе на аноде образуется хлор и кислород, а на катоде — водород. Кроме того, на аноде выделяется кислота, а на катоде — щелочь. Щелочь взаимодействует с хлором, образует гипохлорит, который растворяется в воде и производит обеззараживающий эффект. В то же время большая часть щелочи взаимодействует с бикарбонатами кальция и магния, образуя на катоде осадок. При реверсировании тока катод становится анодом, и на нем начинает выделяться кислота, которая растворяет осадок.

   Реверс пока мало применяется в России из-за отсутствия качественного анодного материала, но нашел широкое применение в иностранных аналогах. Мы, как фирма, которая занимается анодным покрытием с 2003 года, для своих установок серии Сэ предлагаем только реверс для очистки электролизеров.

АСУ ТП

Установки УЭ ГПХН С или Сэ проточного типа работают в автоматическом режиме без присутствия обслуживающего персонала. Оператор требуется для засыпки соли в сатуратор. Пульт управления контролирует работу установки с выдачей звуковых  аварийных сигналов.  Пульт управления собирается на базе отечественных контроллеров. 

— контроль тока и напряжения,

— контроль интервалов между реверсами,

— общее время работы установки,

— контроль температуры до и после электролизера,

— контроль давления на входе воды,

— контроль воздуха на разбавление водорода,

— контроль содержания водорода в помещении,

— дозирование гипохлорита натрия со содержанию остаточного хлора в воде, либо по расходу воды.

Контроль  активного хлора в гипохлорите

Осуществляется методом титрования:

• Поместите приблизительно 50 см3 дистиллированной воды в коническую колбу.

• Добавьте приблизительно 1 г кристаллов иодида калия.

• Добавьте 20 см3 уксусной кислоты (или приблизительно 10 г кристаллов лимонной кислоты)

• При помощи пипетки отберите 5 см3 конечного продукта УЭ ГПХН (как указано выше) и добавьте в колбу. [Раствор окрашивается в насыщенный красно-коричневый цвет в связи с высвобождением йода].

• Титрируйте раствором тиосульфата натрия 0,1 мол. дм– 3, постепенно добавляя его, пока цвет не исчезнет. По мере исчезновения цвета тиосульфат натрия следует добавлять осторожно, по каплям, чтобы точно определить конечную точку.

• Концентрация раствора, выраженная в эквиваленте хлора Cl2, определяется по следующей формуле: мг/л Cl2 = (Т × 3,456 × 1000)/ (Объем пробы),  Где Т – титрирование в см3

Проточный электролизер

Изобретение относится к электролитическому извлечению металлов из растворов, в частности к извлечению благородных металлов из цианисто-щелочных элюатов, и может быть использовано на золотоизвлекательных предприятиях с цианистой и угольно-сорбционной технологией извлечения благородных металлов. Электролизер снабжен успокоительной решеткой, выполненной из вертикальных металлических пластин высотой не менее 20% от высоты электродов, расположенных перпендикулярно продольной оси электролизера и служащих опорой катодам. Катоды выполнены в виде контейнеров, в которые помещена металлическая сетка в виде гофр, расположенных в вертикальном направлении, а аноды выполнены в виде металлических листов с намотанной на них металлической сеткой. Под успокоительной решеткой выполнена отстойная камера в виде одной и более перевернутых пирамид для вывода шлама с углом уклона стенок 55-60° к горизонтали. Техническим результатом является повышение удельной производительности и эффективности процесса, упрощение обслуживания. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

 

Изобретение относится к электролитическому извлечению металлов из растворов, в частности к извлечению благородных металлов из цианисто-щелочных элюатов, и может быть использовано на золотоизвлекательных предприятиях с цианистой и угольно-сорбционной технологией извлечения благородных металлов.

Известен многокамерный проточный электролизер, содержащий попеременно расположенные катоды и аноды, разделенные ионообменными мембранами, в котором аноды выполнены в виде платиновых сеток, помещенных в анодные камеры, каждая из которых выполнена в виде рамок с закрепленными на внешних сторонах ионообменными мембранами, а катоды — в виде блоков из вертикальных пластин, собранных на токопроводящих стяжках с зазором друг к другу и установленных перпендикулярно анодным камерам (А.С. СССР №349753, опубл. БИ №26, 1972 г.).

Недостатками известного электролизера являются: сложность конструкции, недостаточная площадь катодной поверхности, трудность обслуживания.

Известен электролизер для осаждения золота из цианистых растворов, содержащий попеременно расположенные в электродных камерах аноды и катоды, выполненные соответственно из пассивированного свинца и нержавеющей стали. (Алканцев М.И., Способ осаждения золота из цианистых растворов Сборник трудов Северо-Кавказского горно-металлургического института, 1957, вып.15, с.238-258).

К недостаткам известного устройства относится возможность замыкания катодов и анодов флотирующимися катодными осадками, что приводит к потерям осаждаемого металла.

Известен также многокамерный проточный бездиафрагменный электролизер, взятый за прототип (патент 2054051, опубл. БИ №4, 1996 г.), в котором биполярно включенные аноды и катоды, установленные попеременно-параллельно в пазах электродных камер, позволяют сократить межэлектродное расстояние и за счет этого повысить извлечение металла.

К недостаткам известного устройства относится возможность закорачивания анодов и катодов из-за накапливания шламов в межэлектродном пространстве.

Задачей изобретения является повышение производительности и эффективности процесса электролитического извлечения металлов, упрощение обслуживания.

Технический результат заключается в повышении рабочей поверхности, в уменьшении возможности проскока необработанного раствора, в сокращении количества отстойных камер.

Указанный технический результат достигается тем, что в известном электролизере, содержащем металлический корпус, попеременно расположенные катоды и аноды, согласно изобретению ниже катодов и анодов установлена успокоительная решетка, выполненная из вертикальных металлических пластин высотой не менее 20% от высоты катодов и анодов, расположенных перпендикулярно продольной оси электролизера и служащих опорой катодам, при этом катоды выполнены в виде контейнеров, в которые помещена металлическая сетка в виде гофр, расположенных в вертикальном направлении, а аноды выполнены в виде металлических листов с намотанной на них металлической сеткой.

Кроме того, под успокоительной решеткой выполнена отстойная камера в виде одной или более перевернутых пирамид с углом наклона стенок 55-60° к горизонтали и с патрубком для вывода шлама.

Уменьшение возможности проскока растворов, повышение извлечения металлов достигается за счет применения успокоительной решетки и выбранного угла наклона стенок отстойной камеры, что также позволяет повысить компактность электролизера, его объемную производительность, а также предотвратить возможность замыкания катодов и анодов формирующимися катодными осадками.

Выполнение успокоительной решетки высотой не менее 20% от высоты катодов и анодов позволяет сократить вероятность проскока растворов до 3%.

При угле наклона стенок отстойной камеры 55-60° к горизонтали происходит полный сброс осаждаемого шлама. При угле менее 55° происходит заиливание стенок отстойной камеры, при большем угле без должного эффекта увеличиваются габариты аппарата.

Увеличение производительности достигается за счет повышения площади катодов и анодов, которая обеспечивается за счет применения металлической сетки. В катодах металлическая сетка в виде гофр помещена в контейнеры, а в анодах она наматывается на металлические листы, увеличивая тем самым рабочую поверхность.

Улучшение обслуживания достигается за счет того, что выпуск катодного шлама из отстойной камеры производится только через один либо два клапана без остановки процесса электроосаждения.

Проведенный анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно- техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах, позволил установить, что технические решения, характеризующиеся признаками, идентичными всем существенным признакам заявляемому, не обнаружены. Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию «новизна».

Сведений об известности отличительных признаков заявляемого технического решения в совокупностях признаков известных технических решений с достижением тех же результатов, как у заявляемого, не найдено. На основании этого сделан вывод о соответствии заявляемого технического решения условию «изобретательский уровень».

На чертеже представлен электролизер, основной вид.

Электролизер содержит металлический корпус 1, одновременно являющийся катодом, катоды 2, аноды 3, успокоительную решетку 4, шины катодные 5 и шины анодные 6. Для входа исходного раствора предусмотрены карманы 7, для выпуска отработанных растворов — патрубок 8. Для осаждения осадка под успокоительной решеткой 4 выполнена отстойная камера 9, из которой осадок выводят через клапан 10.

Электролизер работает следующим образом.

Раствор поступает в электролизер через карман 7, проходит по щелям между корпусом, катодами и анодами, а также по верхнему пространству успокоительной решетки 4 к противоположной стенке электролизера и, обеззолоченный, поступает в карман 7 и выливается через патрубок 8.

Металл в виде шлама формируется на поверхности катодов 2, осыпается в зону успокоительной решетки 4 и затем в отстойную камеру 9.

Осадок металла по мере накопления выводится из отстойной камеры 9 с небольшим количеством раствора через клапан 10 без прекращения подачи раствора и отключения электроэнергии.

Необходимая степень обезметалливания растворов достигается изменением катодной плотности тока и скорости подачи раствора.

Предлагаемая конструкция электролизера позволяет повысить электродную поверхность и, соответственно, удельную производительность при сокращении занимаемых производственных площадей, а также позволяет исключить замыкание катодов и анодов образующимися частицами металла и тем самым снизить потери осаждаемого металла и повысить эффективность процесса.

1. Проточный электролизер для осаждения из растворов металлов в виде шлама, содержащий металлический корпус, попеременно расположенные катоды и аноды, отличающийся тем, что ниже катодов и анодов установлена успокоительная решетка, выполненная из вертикальных металлических пластин высотой не менее 20% от высоты катодов и анодов, расположенных перпендикулярно продольной оси электролизера и служащих опорой катодам, при этом катоды выполнены в виде контейнеров, в которых помещена металлическая сетка в виде гофр, расположенных в вертикальном направлении, а аноды выполнены в виде металлических листов с намотанной на них металлической сеткой.

2. Электролизер по п.1, отличающийся тем, что под успокоительной решеткой выполнена отстойная камера в виде одной или более перевернутых пирамид с углом уклона стенок 55-60° к горизонтали и с патрубком для вывода шлама.

Электролизер — устройство и принцип работы

Промышленный электролизер – это технологическое оборудование, которое используется при добыче полезных ископаемых и производственных предприятиях для получения некоторых видов газов (хлора, водорода), для производства алюминия и магния. Отдельные виды оборудования могут применяться для обессоливания, обеззараживания и дезинфекции сточных вод.

Конструктивные особенности устройства

Рассмотрим подробнее устройство и принцип работы устройства. Устройство имеет токопроводящий корпус, электроды из разных материалов (медный, цинковый и т. д.) – катод и анод, а также патрубки для ввода внутрь электролита и вывода вещества, которое получают электролитическим методом.

Конструкция оборудования может быть изменения для выполнения специализированных задач. Например, для выделения магния и хлора применяется емкость со стенками, облицованными огнеупорными кирпичами или иными подобными материалами.

При подключении установки к электрическому току электроды, которые опущены в токопроводящую жидкость – электролит – начинают электрохимическую реакцию. Между анодом и катодом протекает ионный ток, а в процессе реакции положительные частицы направляются к катоду, а отрицательные – к аноду. Таким образом электролит разлагается, например, на водород кислород, металлы и хлор.

Если электролизная установка используется для получения газа, образующиеся в процессе реакции пузырьки поднимаются и собираются в емкость с помощью специальных патрубков.

Используется несколько видов электролизеров:

• Сухие;
• Проточные – в них организован постоянный поток электролитической жидкости;
• Мембранные – в этих устройства применяется твердый электролит на полимерной основе;
• Диафрагменные – применяются в случаях, когда нельзя допускать диффузию продуктов электролиза между камерами.

Характеристики электролизеров могут варьироваться в зависимости от области применения и задач, которые решаются с их помощью на производстве.

Где применяются электролизеры?

Основные сферы применения оборудования:

• Получение цветных металлов из растворов;
• Выделение золота из цианистых растворов;
• Разложение воды на кислород и водород;
• Получение хлора из раствора.

Также применяется проточный для нефти электролизер, который используется в комплексах для добычи полезных ископаемых для обеспечения технологического процесса.

Основными преимуществами оборудования является цена, простота обслуживания и высокая производительность, а также большой коэффициент полезного действия.

Как подобрать устройство?

При выборе оборудования для использования в промышленности необходимо обращать внимание на мощность и производительность электролизных установок. Обычно эти параметры указываются в маркировке оборудования. На рынке в России представлены различные модели, среди которых можно подобрать нужный вариант под любое производство.

Электролизер. Виды и типы. Устройство и работа. Применение

Электролизер – это специальное устройство, которое предназначено для разделения компонентов соединения или раствора с помощью электрического тока. Данные приборы широко используются в промышленности, к примеру, для получения активных металлических компонентов из руды, очищения металлов, нанесения на изделия металлических покрытий. Для быта они используются редко, но также встречаются. В частности для домашнего использования предлагаются устройства, которые позволяют определить загрязненность воды или получить так называемую «живую» воду.

Основа работы устройства принцип электролиза, первооткрывателем которого считается известный зарубежный ученый Фарадей. Однако первый электролизер воды за 30 лет до Фарадея создал русский ученый по фамилии Петров. Он на практике доказал, что вода может обогащаться в катодном или анодном состоянии. Несмотря на эту несправедливость, его труды не пропали даром и послужили развитию технологий. На данный момент изобретены и с успехом используются многочисленные виды устройств, которые работают по принципу электролиза.

Электролизер

Электролизер работает благодаря внешнему источнику питания, который подает электрический ток. Упрощенно агрегат выполнен в виде корпуса, в который вмонтировано два или несколько электродов. Внутри корпуса находится электролит. При подаче электрического тока происходит разложение раствора на требуемые составляющие. Положительно заряженные ионы одного вещества направляются к отрицательно заряженному электроду и наоборот.

Основной характеристикой подобных агрегатов является производительность. То есть это количество раствора или вещества, которое установка может перерабатывать за определенный период времени. Данный параметр указывается в наименовании модели. Однако на него также могут влиять и иные показатели: сила тока, напряжение, вид электролита и так далее.

Виды и типы

По конструкции анода и расположению токопровода электролизер может быть трех видов, это агрегаты с:

1. Прессованными обожженными анодами.
2. Непрерывным самообжигающимся анодом, а также боковым токопроводом.
3. Непрерывным самообжигающимся анодом, а также верхним токопроводом.

Электролизер, используемый для растворов, по конструктивным особенностям можно условно разделить на:

• Сухие.
• Проточные.
• Мембранные.
• Диафрагменные.

Устройство

Конструкции агрегатов могут быть различными, но все они работают на принципе электролиза.

Устройство в большинстве случаев состоит из следующих элементов:

• Электропроводящий корпус.
• Катод.
• Анод.
• Патрубки, предназначенные для ввода электролита, а также вывода веществ, полученных в ходе реакции.

Электроды выполняются герметичными. Обычно они представлены в виде цилиндров, которые сообщаются с внешней средой с помощью патрубков. Электроды изготавливаются из специальных токопроводящих материалов. На катоде осаждается металл или к нему направляют ионы отделенного газа (при расщеплении воды).

В цветной промышленности часто применяют специализированные агрегаты для электролиза. Это более сложные установки, которые имеют свои особенности. Так электролизер для выделения магния и хлора требует ванну, выполненную из стенок торцевого и продольного вида. Она обкладывается с помощью огнеупорных кирпичей и иных материалов, а также делится с помощью перегородки на отделение для электролиза и ячейку, в которой собираются конечные продукты.

Конструктивные особенности каждого вида подобного оборудования позволяют решать лишь конкретные задачи, которые связаны с обеспечением качества выделяющихся веществ, скоростью происходящей реакции, энергоемкостью установки и так далее.

Принцип действия

В электролизных устройствах электрический ток проводят лишь ионные соединения. Поэтому при опускании электродов в электролит и включении электрического тока, в нем начинает течь ионный ток. Положительные частицы в виде катионов направляются к катоду, к примеру, это водород и различные металлы. Анионы, то есть отрицательно заряженные ионы текут к аноду (кислород, хлор).

При подходе к аноду анионы лишаются своего заряда и становятся нейтральными частицами. В результате они оседают на электроде. У катода происходят похожие реакции: катионы забирают у электрода электроны, что приводит к их нейтрализации. В результате катионы оседают на электроде. К примеру, при расщеплении воды образуется водород, которые поднимается наверх в виде пузырьков. Чтобы собрать этот газ над катодом сооружаются специальные патрубки. Через них водород поступает в необходимую емкость, после чего его можно будет использовать по назначению.

Принцип действия в конструкциях разных устройств в целом схож, но в ряде случаев могут быть и свои особенности. Так в мембранных агрегатах используется твердый электролит в виде мембраны, которая имеет полимерную основу. Главная особенность подобных приборов кроется в двойном назначении мембраны. Эта прослойка может переносить протоны и ионы, в том числе разделять электроды и конечные продукты электролиза.

Диафрагменные устройства применяются в случаях, когда нельзя допустить диффузию конечных продуктов электролизного процесса. С этой целью применяют пористую диафрагму, которая выполнена из стекла, асбеста или керамики. В ряде случаев в качестве подобной диафрагмы могут применяться полимерные волокна либо стеклянная вата.

Применение

Электролизер

 широко применяется в различных отраслях промышленности. Но, несмотря на простую конструкцию, оно имеет различные варианты исполнения и функции. Данное оборудование применяется для:

• Добычи цветных металлов (магний, алюминий).
• Получения химических элементов (разложение воды на кислород и водород, получение хлора).
• Очистки сточных вод (обессоливание, обеззараживание, дезинфекция от ионов металлов).
• Обработки различных продуктов (деминерализация молока, посол мяса, электроактивация пищевых жидкостей, извлечение нитратов и нитритов из овощных продуктов, извлечения белка из водорослей, грибов и рыбных отходов).

В медицине установки используются в интенсивной терапии для детоксикации организма человека, то есть для создания растворов гипохлорита натрия высокой чистоты. Для этого используется устройство проточного вида с электродами из титана.

Электролизные и электродиализные установки нашли широкое применение для решения экологических проблем и опреснения воды. Но эти агрегаты в виду их недостатков используются редко: это сложность конструкции и их эксплуатации, необходимость трехфазного тока и требования периодической замены электродов из-за их растворения.

Подобные установки находят применение и в быту, к примеру, для получения «живой» воды, а также ее очистки. В будущем возможно создание миниатюрных установок, которые будут использоваться в автомобилях для безопасного получения водорода из воды. Водород станет источником энергии, а машину можно будет заправлять обычной водой.

Похожие темы:

Doorstroomcel

Этот проточный электролизер был разработан, чтобы ограничить количество воды, протекающей через ячейку и, следовательно, увеличить скорость. Это значительно повышает скорость реакции всех измеряемых параметров, что делает ячейку особенно подходящей для низкого расхода / низкой выборки мутности. Даже очень низкий поток падения уровня кислорода будет отмечен сразу, сигнализируя, что свежие бескислородные подземные воды входят в клетку. Это значительно ускоряет процесс очищения и отбора проб. Мёртвый объем клетки (без датчиков) составляет около 250 мл. Узкий диаметр обеспечивает достаточно высокую верхнюю скорость для точных измерений по всем параметрам. Есть только три части для чистки и возможна простая разборка одной рукой. Прибор подходит для любого датчика от 4 мм до 26 мм, и есть разъемы для подключения образцов труб различных размеров. «Умные» перебрасывающиеся ножки делают транспортировку легкой, полевую установку быстрой и эффективной. Несмотря на низкий расход продувка осуществляется на потоки <500 мл / мин, ячейка может легко обрабатывать до 2000 мл / мин без утечки. При более высоких потоках часть потока может быть передана от ячейки с простым тройником в трубки, которые ведут к ячейке.

Преимущества Проточный электролизер

• Легко выполняет полевые измерения pH/электропроводимости/O2/окислительно-восстановительного потенциала
• Совместим практически со всеми предлагаемыми на рынке электродами
• Принцип работы позволяет выполнять измерения при нуле % O2
• Простота очистки, песок не представляет угрозы
• Проверенная в полевых условия простота и долговечность

Области применения:

• Для обеспечения точной, анаэробной мобильности в линии измерения параметров качества воды таких, как рН, окислительно-восстановительные, ЕС, T, O2 и др.
• На наблюдательных скважинах для ускорения процесса очистки, особенно в сочетании с методом очистки низкого расхода потока.
• Для обеспечения необходимой скорости потока к датчику O2 и, следовательно, повышения точности.
• При желании (рН в некоторых случаях) измерения в стоячей воде возможны с помощью простого блокирования поступления водного потока.

 

 

Электролизные установки

1. Главная
2. Электролизные установки

 

Электролизные установки производительностью:

от 1,0 до 100 кг.а.х./сутки
свыше 100 кг.а.х./сутки

 

Специалистами ЗАО «НПФ «Юпитер» реализован промышленный способ обработки воды низкоконцентрированным электролитическим гипохлоритом натрия и разработан типовой ряд проточных электролизеров для осуществления этого способа.

 

Для получения гипохлорита натрия используется, искусственный раствор поваренной соли подземная минерализованная вода с повышенным содержанием хлорида натрия, или морская вода.

 

Электролиз осуществляется в проточном режиме подачи минерализованной воды через электролизер. На выходе электролизера получаем водный раствор гипохлорита натрия с концентрацией по активному хлору до 8,0 г/л.

 

Системы и узлы:

1) резервуар мокрого хранения и приготовления насыщенного раствора соли;
2) электролизная установка;

3) система трубопроводов с трубопроводной арматурой;
4) система принудительной вентиляции;
5) система электроснабжения, автоматики и КИП;
6) узел кислотной промывки;
7) установка умягчения воды.

 

Электролизная установка включает в себя:

1) проточный электролизер;
2) выпрямитель постоянного тока;
3) буферный резервуар;
4) насос для перекачки ГПХН.

 

Технологический процесс получения водного раствора гипохлорита натрия заключается в следующем: – минерализованная вода насосом по напорному трубопроводу подается в электролизеры. Количество воды, поступающей на электролизеры, устанавливается с помощью задвижек и контролируется счетчиками воды на входах в электролизеры; – Протекающая через электролизеры вода подвергается электролизу. На выходе электролизера образуется раствор гипохлорита натрия

Раствор гипохлорита натрия поступает из электролизеров в буферные резервуары. Из буферных резервуаров раствор насосами подается на обеззараживание, при этом количество активного хлора регулируется производительностью насосов подачи гипохлорита.

 

Технология и оборудование электролизной при работе на подземной минерализованной воде и при работе на растворе поваренной соли практически аналогичны.

Типовой ряд проточных электролизеров производства ЗАО «НПФ «Юпитер» обеспечивает единичную производительность от 0,05 до 10 кг/ч гипохлорита натрия по активному хлору.

Технология фирмы «ЮПИТЕР» позволяет:

 

– ликвидировать высокотоксичное хлорное хозяйство;

– обеспечить экологическую и технологическую безопасность на ВОС;

– cнизить концентрацию хлорорганических cоединений в питьевой воде и стоках;

– обеспечить высокую эксплуатационную надежность водоподготовки;

– повысить коррозионную стойкость трубопроводов.

 

Электролизные установки могут использоваться для обеззараживания воды не только на водопроводных станциях, но и в бассейнах, дачных поселках, на теплоэлектростанциях для очистки трубопроводов от биозарастания, в больницах и т.д. – везде, где есть необходимость обеззараживания воды или стоков.

 

Объем получаемого реагента можно увеличить, разместив на объекте, где осуществляется обеззараживание, необходимое число электролизных установок из предлагаемого типового ряда.

Экологический эффект при отказе от технологии обеззараживания хлором очевиден, а капитальные затраты на внедрение данной технологии, как показывает практика, полностью окупаются в течение двух–пяти лет, в зависимости от мощности установки.

 

Дополнительно по заказу

Автоматизированная система дозирования гипохлорита натрия по заданному остаточному хлору после первичного и (или) вторичного хлорирования.

Проточный ионизатор электролизёр воды Esperon, Ашбах 05, цена 43690 грн.

— Перевод нерастворимых солей минералов в доступное для организма состояние: ионизатор переводит нерастворимые в воде соли минералов в ионную форму, делая их таким образом на 100% биологически доступными для организма.

— Производство антисептика и дезинфектанта: одновременно с питьевой очищенной антиоксидантной водой, электроактиватор производит дезинфектант, который можно использовать в быту для мытья рук, дезинфекции посуды, мяса, овощей и фруктов.

Ионизатор «Ашбах 05» имеет два варианта инсталяции:
1. Стандартный вариант
2. Вариант «Скрытое подключение»

Список инструкций по болезням, которые можно лечить с помощью этого аппарата:

• Ангина и хронический тонзиллит
• Атопический дерматит
• Профилактика и коррекция морщин
• Жирная себорея лица, осложненная угревой сыпью
• Остеопороз (с добавлением микроэлементов)
• Пиелонефрит и хронический цистит (с добавлением микроэлементов)
• Хронический колит (с добавлением микроэлементов)
• Гастрит с повышенной кислотностью (с добавлением микроэлементов)
• Изжога (с добавлением микроэлементов)
• Хронический гепатит и цирроз печени (с добавлением микроэлементов)
• Дисбактериоз
• Оздоровительные процедуры
• Закаливание детей
• Лечение  выпадения волос

Вода с отрицательным редокс-потенциалом — эффективное средство защиты организма от радиации

Чем совершенней организм в эволюционном плане, тем он более чувствителен к радиации. Так, у например дозы радиации по своему смертельному воздействию различаются в тысячи раз:
400-600 Р – смертельная доза для человека; 
800-1000 Р – смертельная доза для кролика;
18000 — 300000 – для инфузорий.

При воздействии на организм низких уровней радиации патологические процессы формируются медленно, т.к. имеют место защитно-адаптационные механизмы, которые компенсируют повреждение. Эффективно защищают от радиации радиопротекторы — вещества, обладающие антиоксидантными и иммуностимулирующими свойствами, способные вывести из организма радионуклеотиды.

Что происходит при воздействии радиации на организм человека?
При воздействии радиации фотон, нападает на молекулы нашего организма и «выбивает» из нее электрон. Молекула оказывается поврежденной, у нее не хватает электрона , она превращается в свободный радикал. Если образование свободных радикалов повышено, то антиоксидантная система не в состоянии «погасить» неконтролируемый процесс свободно радикального окисления, что приводит к гибели всего организма.

Вода с отрицательным редокс-потенциалом ( насыщенная электронами), является одним из эффективнейших антиоксидантов ( радиопротекторов) нашего времени. Учеными установлено, что вода с отрицательным потенциалом останавливает реакции свободнорадикального окисления, так как имеет свободные электроны, которые она отдает поврежденным молекулам. Католит ( живая вода) имеет антиоксидантные, детоксицирующие и радиопротекторные свойства, оказывает благотворное действие на минеральный обмен, выводит из организма тяжелые металлы и радионуклиды.

Информация

Проточная кювета MinION (R9.4.1) — это расходный материал, используемый с устройствами MinION и GridION. Он содержит запатентованную матрицу датчиков, специализированную интегральную схему (ASIC) и нанопоры R9.4.1, подходящие для всех одномерных экспериментов.

Как это работает:

Пользователь просто добавляет свою подготовленную библиотеку в проточную ячейку и начинает свой эксперимент по секвенированию.

Данные накапливаются с течением времени по мере того, как ДНК или РНК секвенируются нанопорами.Создаются отдельные файлы для чтения, которые сразу же доступны для анализа.

Поскольку данные передаются в режиме реального времени, пользователь может остановить запуск, как только будет собрано достаточно данных. Проточная кювета содержит буфер, достаточный для работы в течение ~ 48 часов (при оптимальных условиях), и пользователь может выбрать непрерывный запуск или запуск, остановку, промывку и загрузку нового образца до тех пор, пока буфер и нанопоры не будут исчерпаны.

Отгрузка и логистика:

Проточные кюветы MinION и GridION упаковываются индивидуально; тем не менее, доступны варианты оптового заказа.Все заказы могут быть разделены для доставки в соответствии с вашими потребностями.

Проточные кюветы и комплекты поставляются вместе при температуре 2–8 ° C. Упаковка предназначена для защиты проточных ячеек от замерзания. Проточные кюветы стабильны при температуре окружающей среды в течение 30 дней, а наборы для секвенирования стабильны при комнатной температуре до семи дней, поэтому пользователи не должны беспокоиться о своих продуктах, если они прибудут при температуре окружающей среды.

Товары отправляются покупателям в США и ЕС с понедельника по четверг.Доставка в Канаду, Норвегию, Корею и Японию ускоряется с понедельника по среду; Австралия и Новая Зеландия покидают наши склады в пятницу. Доставка в остальные страны мира осуществляется по понедельникам, чтобы обеспечить прибытие посылок в течение всей рабочей недели.

Стоимость доставки рассчитывается при повышении цены или во время оформления заказа. После того, как заказ сделан, идентификатор доставки и информацию о доставке можно отслеживать в Магазине.

Хранение и стабильность:

Пожалуйста, храните проточные кюветы следующим образом:

• Комнатная температура: проточные кюветы можно хранить, , в закрытом виде, , при комнатной температуре в течение одного месяца.
• 2-8 ° C: проточные кюветы можно хранить, в закрытом виде , при 2-8 ° C в течение 12 недель.

Мы рекомендуем вам проверить проточную кювету перед подготовкой библиотеки ДНК / РНК в рамках гарантийного процесса.

Возврат проточной кюветы:

Мы просим клиентов вернуть использованные проточные кюветы в Oxford Nanopore Technologies для переработки. Для получения дополнительной информации см. Раздел «Возврат проточной кюветы».

Рабочий процесс

Проточные кюветы MinION и GridION поставляются в запечатанном пакете и поставляются при постоянной температуре.

Новейшая упаковка проточных кювет позволяет пользователям хранить проточные кюветы при комнатной температуре до одного месяца (когда упаковка не распечатана).

Для более длительного хранения рекомендуется хранить их в закрытом виде при 2-8 ° C.

Перед использованием проточную кювету можно проверить, выполнив проверку проточной кюветы с помощью MinKNOW (программное обеспечение устройств MinION и GridION). Проверка проточной кюветы сообщит о количестве нанопор, доступных для секвенирования.

После того, как проверка проточной кюветы будет выполнена удовлетворительно, проточная кювета готова к использованию для экспериментов.Точный протокол и используемые наборы реагентов будут зависеть от проводимого эксперимента.

Верните проточные кюветы в Oxford Nanopore Technologies после использования.

Безопасность и правовые нормы

Паспорт безопасности буфера проточной кюветы MinION

Клиенты должны выполнить проверку проточной кюветы в течение 3 месяцев с момента покупки. Oxford Nanopore Technologies заменит любую проточную кювету с менее чем 800 нанопорами, если результат будет сообщен в течение двух дней после выполнения проверки проточной кюветы и если будут соблюдены рекомендации по хранению.Мы считаем, что срок полезного использования этого продукта составляет 12 недель с момента получения покупателем.

Срок действия контракта на все закупки расходных материалов составляет 1 год.

Комплектация

Проточные кюветы MinION

поставляются в запечатанном пакете.

Эта упаковка также служит комплектом для возврата проточной ячейки. Просим пользователей вернуть свои проточные кюветы после использования, чтобы они могли быть переработаны Oxford Nanopore Technologies.

Мультиплексирование

Наборы штрих-кодирования Oxford Nanopore предназначены для объединения и запуска нескольких библиотек на устройствах Oxford Nanopore.Существует три типа наборов штрих-кодирования:

Штрих-кодирование ПЦР на основе лигирования:

Штрих-кодирование быстрой химической ПЦР:

Нативное штрих-кодирование (без ПЦР):

В качестве альтернативы набор для промывки проточных кювет позволяет выполнять последовательные запуски нескольких секвенирований библиотеки в одной проточной ячейке. Он работает, стирая первую библиотеку и обновляя систему, готовую к загрузке следующей библиотеки. Эта процедура дает возможность использовать одну и ту же проточную кювету несколько раз, максимально увеличивая доступное время выполнения, особенно в случаях, когда требуется меньше данных для каждой библиотеки.После стадии промывки буфер для хранения вводится в проточную кювету, что позволяет хранить проточную кювету перед последующим добавлением библиотеки.

Совместимость

Проточные кюветы

R9.4.1 подходят для всех наборов для одномерного секвенирования:

• Набор для лигирования секвенирования (SQK-LSK110)
• Набор для лигирования секвенирования (SQK-LSK109)
• Набор для секвенирования Cas9 (SQK-CS9109)
• Набор для сверхдлинного секвенирования ДНК (SQK-ULK001)
• Набор для ПЦР-кДНК (SQK-PCS109)
• Набор для прямого секвенирования кДНК (SQK-DCS109)
• Набор для прямого секвенирования РНК (SQK-RNA002)
• Быстрое секвенирование Набор (SQK-RAD004)
• Набор для быстрого штрих-кодирования (SQK-RBK004)
• Набор для быстрого штрих-кодирования 96 (SQK-RBK110.96)
• Набор штрих-кодирования для быстрой ПЦР (SQK-RPB004)
• Набор для штрих-кодирования 16S (SQK-RAB204)
• Набор для штрих-кодирования 16S 1-24 (SQK-16S024)
• Набор для секвенирования ПЦР (SQK-PSK004)
• Штрих-кодирование ПЦР Комплект (SQK-PBK004)
• Комплект для полевого секвенирования (SQK-LRK001)
• Комплект для секвенирования VolTRAX (VSK-VSK003)
• Мультиплексный комплект VolTRAX (VSK-VMK002)

Новая парадигма секвенирования проточной кюветы

Аннотация

Секвенирование ДНК

переживает период быстрых изменений, когда капиллярное секвенирование больше не является технологией выбора для большинства
приложения со сверхвысокой пропускной способностью.Новое поколение инструментов, которые используют примированный синтез в проточных ячейках для получения,
одновременно последовательность миллионов различных шаблонов ДНК изменила поле зрения. Мы сравниваем и противопоставляем эти новые
платформы для секвенирования с точки зрения стадии разработки, конфигурации прибора, формата шаблона, химии секвенирования, пропускной способности
возможности, эксплуатационные расходы, проблемы с обработкой данных и модели ошибок. Хотя эти платформы превосходят капиллярные инструменты
с точки зрения количества баз в день и стоимости базы, короткая длина последовательностей считываний, полученных от большинства инструментов, и ограниченная
Количество образцов, которые можно запускать одновременно, накладывает некоторые практические ограничения на приложения для секвенирования.Однако недавно
разработаны методы для парного секвенирования и для прямого выбора на основе массивов желаемых шаблонов из сложных смесей
расширить возможности этих платформ для анализа генома. Учитывая постоянно растущий спрос на информацию о последовательностях ДНК,
мы можем ожидать постоянного улучшения этого нового поколения инструментов и их возможной замены на еще более мощные
технология.

С момента установления ДНК в качестве наследственного материала и выяснения ее структуры существует ненасытный спрос.
за информацию о последовательности и замечательные инновации в методах ее получения.Как и многие технологии, секвенирование ДНК
продвинулась за счет прерывистого равновесия, когда новый подход к секвенированию вводится, внедряется и постепенно улучшается.
в течение некоторого периода времени, затем сменяется следующей волной. Самые ранние методы секвенирования включали вариации
тема расщепления коротких полинуклеотидов и последующей идентификации по их миграционным характеристикам с использованием двумерных
бумажная хроматография.Используя этот подход, можно было вывести короткие последовательности, такие как последовательность lac-оперона Escherichia coli (Gilbert and Maxam 1973), и в то время было возможно представить данные всего проекта секвенирования в аннотации статьи. Переход
большого значения была инициирована группой Сангера в середине 1970-х годов, когда они представили понятие использования грунтованного
репликация матрицы с помощью полимеразы и разделение продуктов удлинения с помощью гель-электрофореза (Sanger and Coulson 1975) для получения информации о последовательности ДНК.Модификация этого подхода для обеспечения возможности обрыва цепи с помощью дидезоксинуклеотидов, специфичных для оснований.
(Sanger et al. 1977) заложили основу для секвенирования на следующие 30 лет. Дальнейшие улучшения за это время включали использование
флуоресцентные, а не меченные радиоактивным изотопом терминаторы, разделение на акриламидных матрицах в капиллярах, а не в пластинчатых гелях,
и, в конечном итоге, развертывание механизированных производственных линий для подготовки шаблонов и устройств для автоматизированного производства
и чтение лестничных диаграмм.Этот промышленный подход к секвенированию породил современную эру геномики и обеспечил
архив полных референсных последовательностей генома. Тем не менее, спрос на последовательность ДНК не уменьшается, и мы находимся в затруднительном положении.
новый период стремительных перемен. Если отличительной чертой прошлой парадигмы было электрофоретическое разделение терминированных цепей ДНК,
тогда отличительной чертой новой парадигмы является секвенирование проточной кюветы с пошаговым определением последовательности ДНК с помощью итерационных циклов.
удлинений нуклеотидов, выполняемых параллельно на огромном количестве клонально амплифицированных молекул-шаблонов.Если взять широкий
вид проточной кюветы как реакционной камеры, которая содержит матрицу, привязанную к твердой подложке, к которой прикреплены нуклеотиды и вспомогательные вещества.
реагенты многократно наносятся и смываются, затем новые инструменты на рынке (Roche GS-FLX, Illumina 1G
анализатор и Applied Biosystems SOLiD) являются секвенсорами проточных ячеек (как и инструменты, которые появятся в ближайшем будущем).
такие как Helicos HeliScope и Danaher Polonator).Массивно параллельные подходы с использованием проточных кювет позволяют секвенировать ДНК
заметно быстрее и дешевле, чем когда-либо прежде. Это означает, что направления научных исследований, которые когда-то были непомерно дорогими,
теперь осуществимы, и это хорошо, потому что есть что исследовать. Например, были составлены последовательности генома человека.
но представляют собой ничтожную долю от ~ 100 миллионов килограммов человеческой ДНК, которая присутствует на планете в любой данный день. Это
уверен, что новый шаблон из биосферы будет продолжать стимулировать последовательные волны инноваций в технологии секвенирования
на какое-то время.

Техника

Шаблоны и химические методы секвенирования

В то время как все новейшие коммерческие инструменты для секвенирования используют проточные кюветы и массовое распараллеливание для улучшения секвенирования
емкость, специфика подготовки матрицы, химия секвенирования и конфигурация проточной кюветы различаются между платформами.Часто существует неправильное представление о том, что новое поколение секвенаторов выполняет секвенирование отдельных молекул. Фактически все
доступные в настоящее время платформы (Roche GS-FLX, анализатор Illumina 1G и Applied Biosystems SOLiD) требуют
амплификация фрагментированной матричной ДНК для получения сигнала, достаточного для вызова основания. Однако в этих методах используется один
Молекула ДНК в качестве исходного субстрата для амплификации, позволяющая каждой секвенированной молекуле представлять один гаплотип.Это оказалось полезным для надежного обнаружения полиморфизма, особенно в материале, полученном от рака, где связаны нормальные
ткань может скрывать гетерозиготные вызовы с использованием традиционного секвенирования продуктов ПЦР по Сэнгеру. Как обсуждается ниже,
Прибор, разрабатываемый Helicos, на протяжении всего анализа использует одну молекулу.

Премьерой секвенирования проточной кюветы стал GS20 (454 Life Sciences), который за один запуск машины обеспечивал последовательность
данные для сборки de novo генома Mycoplasma genitalium с 96% покрытием на 99.Точность 96% (Маргулис и др., 2005). Текущая модель этого прибора — GS-FLX, продаваемая Roche Applied Science, но основная технология осталась прежней,
и этот метод все еще называют секвенированием 454. Проточная кювета 454 поддерживает пластину «пикотитер», оптоволоконный слайд.
с ~ 1,6 миллиона 75-пиколитровых лунок. Для секвенирования 454 матрицу амплифицируют с помощью эмульсионной ПЦР следующим образом. Использование ограничения
При разведении каждая отдельная молекула разрезанной матричной ДНК захватывается отдельной гранулой, и каждая гранула разделяется на секции
в частной капле водной реакционной смеси ПЦР в масляной эмульсии.Шаблон клонально усилен на поверхности шарика.
термоциклированием, и загруженные шаблоном шарики затем распределяют в лунки планшета для пикотитра, в идеале с одним
или меньше бусинок на лунку. Последовательность получают с помощью итеративного пиросеквенирования (Nyren et al. 1993; Ronaghi et al. 1996, 1998), при котором лунки однократно загружаются связанными с гранулами ферментами секвенирования (полимераза, сульфурилаза и люцифераза) и буфером.
содержащий один из четырех дНТФ проходит горизонтально над лунками.Если есть совпадение с загрунтованным шаблоном, полимераза
включает нуклеотид и высвобождает молекулу пирофосфата, которая при превращении в АТФ с помощью сульфурилазы образует
люминометрический сигнал, катализируемый люциферазой. После вымывания остаточных нуклеотидов цикл повторяется со следующим dNTP.
Поскольку используются dNTP, гомополимеры в матричной ДНК представляют потенциальную проблему для химии секвенирования, поскольку они
позволяют включение нескольких нуклеотидов в один поток.Увеличение наблюдаемой люминесценции позволяет длине
гомополимера, который необходимо оценить, но способность различать уменьшается с увеличением длины гомополимера. Дискриминация
является надежным для четырех оснований, а гомополимеры, приближающиеся к восьми основаниям, обычно неразрешимы (Margulies et al. 2005; Huse et al. 2007), хотя это постоянно улучшается за счет более совершенного программного обеспечения и уменьшения перекрестных помех между скважинами. Дальнейшие проблемы с
подход 454 — неудачные лунки из-за неполного удлинения гомополимера, неправильного включения избыточных нуклеотидов
которые не были полностью смыты после предыдущего цикла, бусины со смешанными шаблонами и несколько копий одного и того же шаблона
на разные бусинки.Хотя подход 454 к пиросеквенированию сначала кажется несколько сложным и непрямым, и хотя
гомополимеры, эффекты переноса и фазирования могут быть проблематичными, было опубликовано более 100 исследований с использованием этой технологии
и являются свидетельством его полезности и надежности.

После системы 454 следующей платформой на рынке был анализатор 1G, разработанный Solexa, который теперь принадлежит и продается.
Автор: Illumina (www.illumina.com). Это первая из массово параллельных короткочитаемых платформ. Проточная кювета Illumina представляет собой плоскую оптически прозрачную
поверхность похожа на предметное стекло микроскопа, которое содержит лужайку олигонуклеотидных якорей, связанных с его поверхностью. Подготовить шаблон
ДНК, адаптеры, комплементарные олигонуклеотидам на поверхности проточной кюветы, лигируются с концами ДНК выбранного размера. Адаптированный однониточный
ДНК связываются с проточной кюветой и амплифицируются следующим образом с помощью твердофазной «мостовой» ПЦР.В каждом цикле ПЦР происходит праймирование.
за счет изгиба молекулы-шаблона таким образом, что адаптер на его непривязанном конце гибридизуется со свободным олигонуклеотидом и примируется им.
в непосредственной близости от поверхности проточной кюветы. В результате этого процесса образуется образец капель дождя из клонально усиленных шаблонов.
Секвенирование осуществляется путем синтеза с использованием обратимой четырехцветной флуоресценции (например, смесь четырех оснований, каждое из которых помечено
другой расщепляемый флуорофор, так что их можно использовать одновременно, а не последовательно, чтобы исследовать данный
положение нуклеотида в шаблоне).Меченые терминаторы, праймер и полимераза наносят на проточную ячейку. После базы
продление и запись флуоресцентного сигнала в каждом кластере, реагенты для секвенирования смываются, метки отщепляются,
и 3′-конец включенного основания разблокируется при подготовке к следующему добавлению нуклеотида. Ключевые нововведения
этой системы являются усиление шаблона in-situ и четырехцветные терминаторы типа Сэнгера, но обратимые.Новая версия
Ожидается, что прибор Illumina (GAII) с улучшенной оптикой сможет работать с более высокой плотностью скоплений.

Из платформ, которые в настоящее время коммерчески доступны, последним дополнением является SOLiD (Supported Oligonucleotide Ligation
and Detection) от Applied Biosystems. Некоторые элементы платформы прямо аналогичны функциям
системы 454 и Illumina.Как и в случае с системой 454, амплификация матрицы осуществляется с помощью эмульсионной ПЦР, как и в случае с системой Illumina.
В системе шаблон наносится с высокой плотностью на проточную кювету. Нет отделения бусинки от шаблона, а скорее,
после этапа отбраковки неудачных шариков шаблон откладывается на проточную кювету, шарик и все остальное. Ключевая отличительная черта
Платформа SOLiD, как следует из названия, представляет собой химию секвенирования на основе лигирования. Подход к лигированию основан на раннем
работа, характеризующая термостабильную лигазу (Barany and Gelfand 1991; Housby and Southern 1998) и последующее внедрение протокола высокопроизводительного секвенирования группой Чёрча (Shendure et al.2005). В этом плодотворном исследовании эмульсионная ПЦР-амплифицированная ДНК из E. coli MG1655 была подвергнута 26 циклам секвенирования путем лигирования для получения 1,16 миллиона отображаемых считываний. Объединяя эти чтения
с данными из отдельного прогона обеспечили охват 91,4% генома E. coli . Интересно, что в этой работе церковной лаборатории использовались стандартные приборы и реагенты, а также пакет
разрабатывается для коммерческого распространения компанией Danaher Motion как платформа для секвенирования «Полонатор».

В отличие от секвенирования на основе полимеразы, при секвенировании путем лигирования основания предполагаются косвенно на основе успешного лигирования.
События. Как реализовано на платформе SOLiD, праймер, комплементарный последовательности адаптера на стыке шаблон / гранула
обеспечивает 5′-фосфатную группу, с которой меченные четырехцветным красителем олигонуклеотиды конкурируют за лигирование. Каждый олиго имеет три универсальных
оснований затем два фиксированных основания, так что фактические опрашиваемые основания смещены на три нуклеотида от точки
перевязка.Кроме того, олигонуклеотиды являются терминаторами лигирования, и только после расщепления флуоресцентной метки, очищая проточную ячейку,
и лигирование свежими реагентами может предполагать дополнительные основания. Во втором раунде перевязки опрашиваемых оснований
не являются последовательными, а скорее смещены от первоначально запрошенной пары оснований тремя универсальными основаниями на конце 5 ‘
второго инкорпорированного олиго. Таким образом, шаблон сначала упорядочивается на каждой четвертой и пятой основе, как правило,
семь циклов.Затем для получения пропущенных оснований лигированные олигонуклеотиды удаляют, наносят новый праймер n -1 и процесс повторяется. Выполняются четыре полных серии лигирования, каждая смещена на один нуклеотид,
так что каждую базу опрашивают дважды. Эта схема называется «двухбазовое кодирование», а двойной запрос
обеспечивает механизм проверки ошибок и, следовательно, более высокую общую точность. Однако двухбазовый метод кодирования вводит
уровень абстракции по сравнению с другими химическими методами секвенирования.Двухосновное кодирование напрямую не обеспечивает последовательность ДНК, а, скорее,
информация о смежности между парами оснований, где каждый цвет представляет любой из четырех возможных динуклеотидов. Результат
вырожденный четырехцветный алфавит, названный «цветовым пространством». В цветовом пространстве однонуклеотидные полиморфизмы идентифицируются как
два соседних изменения цвета. Однако ошибки последовательности приводят к «сдвигу кадра» во время трансляции цветового пространства.
последовательность в текст (например,g., A, G, C и T), и в результате предполагаемая последовательность ДНК будет полностью ошибочной. Избегать
производитель рекомендует проводить весь последующий анализ в цветовом пространстве. Для этого необходимо, чтобы
контрольные последовательности генома в текстовом формате должны быть преобразованы в цветовое пространство перед выравниванием последовательностей и последующим анализом.
Некоторые алгоритмы выравнивания, такие как Maq (http://maq.sourceforge.net/maq-man.shtml), уже предоставляют некоторые инструменты для облегчения преобразования в цветовое пространство и из него.Еще неизвестно, будет ли цвет
пространство будет легко воспринято сообществом как новый синтаксис для нуклеотидной последовательности.

Пока нет коммерчески доступных платформ для истинного секвенирования одной молекулы, но ожидается, что это будет
изменение с появлением прибора HeliScope от Helicos. Эта платформа началась с плодотворной работы.
в лаборатории Quake (Браславский и др.2003), где длины чтения до пяти оснований были получены путем праймированного синтеза одиночных матриц, иммобилизованных в кварцевом потоке.
клетка. Праймеры были помечены Cy3 для регистрации местоположения каждой молекулы-шаблона и обнаружения встроенных оснований.
за счет резонансного переноса энергии однопарной флуоресценции Cy3 / Cy5 уменьшил эффект фоновой флуоресценции до точки, где
отдельные молекулы могли быть надежно отображены. После визуализации потребовалось фотообесцвечивание для обнаружения следующего включенного
нуклеотид.Платформа Helicos индустриализировала этот подход и внесла некоторые ключевые изменения. В основном флуоресцентные
метки расщепляются между циклами, а не фотообесцвечиваются, а аналоги нуклеотидов, называемые «виртуальными терминаторами», были
разработаны, которые уменьшают процессивность полимеразы, позволяя ей проходить через серию идентичных оснований по одному.

Использование отдельных молекул ДНК в качестве матрицы для секвенирования затрудняет обнаружение сигнала и представляет серьезную проблему для
этот подход.Однако обнаружение одиночных молекул имеет следующее ключевое преимущество. Теоретически из-за отсутствия дефазировки
(затухание сигнала из-за неправильного расширения / нерасширения в подмножестве клонально амплифицированных молекул-шаблонов), каждое расширение основания
должен быть таким же детектируемым, как и первый, обеспечивая длину считывания, ограниченную только размером молекул шаблона. На практике,
длины чтения из шаблонов одной молекулы, по-видимому, не дают таких расширений чтения.Причины этого не ясны, но
могут быть связаны со вторичными конформациями, принимаемыми ДНК, которые препятствуют эффективному секвенированию. Качество реагента также может
оказывать влияние. Поскольку при секвенировании матрицы необходимо обнаруживать добавление одной молекулы нуклеотида, нуклеотид
который не удалось ковалентно пометить флуорофором, не сможет обеспечить сигнал для этого основания. Поэтому в
в отличие от методологий секвенирования, которые используют несколько молекул-шаблонов, которые могут допускать немаркированную часть фракции,
вполне вероятно, что потребуются более строгие и более дорогие производственные процессы для обеспечения реагентов для этих
одномолекулярные платформы.Чтобы обойти эту проблему и, возможно, другие стохастические проблемы при обнаружении одной меченой молекулы,
можно отделить синтезированную цепь от матрицы и изменить последовательность один или несколько раз. Такой подход поддерживается
платформой Helicos и обеспечивает средства повышения качества последовательности, но за счет увеличения используемых расходных материалов.
и время работы машины. В принципе, до изменения последовательности включение контролируемых количеств немеченых оснований обеспечивает
средства для отбора образцов шаблона в различных положениях, в результате чего получается ряд связанных последовательностей или даже целое ружье
секвенирование самой короткой последовательности шаблона при достаточном количестве итераций.

Парные методы

Из-за ограниченной длины любой считываемой последовательности получение информации с противоположных концов длинных шаблонов было затруднено.
в течение некоторого времени признается как средство получения позиционной информации для облегчения сборки последовательностей (Roach et al. 1995). Ультракороткие считывания, производимые большинством современных секвенсоров проточных кювет, делают подходы с парным концом еще более эффективными.
неотразимый.На всех платформах разработаны стратегии парного секвенирования. Матрицы ДНК для секвенирования проточных кювет обычно
выбранный размер составляет несколько сотен оснований в длину, но метод получения последовательности с обоих концов различается для разных платформ.
Подход Illumina заключается в повторном синтезе шаблона, и для этого требуется модифицированная проточная кювета с парным концом и другой
аппаратный модуль для мостовой ПЦР. Первую концевую последовательность получают путем амплификации, линеаризации и дегибридизации
ДНК для получения одноцепочечной матрицы, ковалентно присоединенной к проточной ячейке, с последующим примированным синтезом.Чтобы получить последовательность
на противоположном конце регенерируется двухцепочечная матрица, а противоположная цепь дегибридизируется и секвенируется с помощью праймированного
синтез. Этот подход очень похож на подход Helicos, где шаблон с полиА-хвостами отжигается и грунтуется потоком.
связанные с клетками polyT-олигонуклеотиды. После многочисленных циклов секвенирования считывание расширяется до противоположного конца шаблона без маркировки.
оснований, исходная матрица расплавляется, и последовательность на дальнем конце молекулы получается путем обратного праймированного синтеза.
по направлению к проточной ячейке, используя ранее синтезированную нить в качестве матрицы.Аналогичным образом, подход ABI к получению пары матов
Последовательность, по-видимому, запускает серию лигирования с 5′-конца первой, а затем второй стойки матрицы. Высший
длины чтения, предлагаемые системой 454, являются явным преимуществом при секвенировании парных концов, поскольку могут быть получены оба конца
просто прочитав весь шаблон.

Для всех платформ требуется, чтобы длина шаблона, непосредственно используемого в проточной кювете, не превышала нескольких сотен пар оснований.Сбежать
это ограничение и получить последовательность пар сопряжений, разделенных большими расстояниями, тот же базовый подход циркуляризации шаблона
и используется расщепление, которое изначально было разработано для быстрого получения информации о далеких парах спаривания при секвенировании дробовиком.
проектов (Вентер и др., 2001; Холт и др., 2002; Мурал и др., 2002; Гиббс и др., 2004). Вкратце, ДНК разрезают, точно выбирают по размеру и рециркуляризируют в присутствии сайтов-носителей наполнителя для типа
Ферменты рестрикции IIS, такие как MmeI или EcoP15I, которые расщепляют ниже своей последовательности узнавания.Сайты ограничения
имеют противоположную ориентацию, так что после переваривания короткие (∼18–25 п.н.) фрагменты, состоящие из наполнителя, фланкированного концом
Теги последовательности изолированы и используются в качестве шаблона для секвенирования. Чтобы решить проблему уникального картирования сложных геномов,
метки с короткой последовательностью, производимые ферментами типа IIS, был разработан метод случайного сдвига, который генерирует гораздо более длительные
концевые сегменты (Korbel et al.2007). Здесь к исходным линейным фрагментам ДНК добавляются биотинилированные линкеры. Эти модифицированные по концам ДНК затем подвергаются циркуляризации посредством
перевязка, как указано выше. Затем круги ДНК случайным образом разрезаются распылением, и биотинилированные адаптерные последовательности теперь
фланкированные концевыми последовательностями исходной ДНК, захватываются стрептавидиновыми гранулами для последующего секвенирования. На сегодняшний день это
подход был использован для секвенирования 454, но в принципе он применим ко всем платформам, и его полезность должна возрасти
по мере улучшения возможностей чтения.

В то время как все подходы с парным концом имеют огромную полезность для получения информации о положении, которая может облегчить сборку и
позволяют обнаруживать варианты конструкции, важно отметить, что для всех платформ, кроме 454, стоимость и время работы
для протоколов с парным концом по существу вдвое превышают требования подходов с однократным чтением.

Целевое секвенирование

Подходы к секвенированию с использованием проточной кюветы

лучше всего подходят для создания большого количества данных (от Мбит / с до Гбит / с) на одном или небольшом количестве образцов.Миллионы считываний по Сэнгеру были созданы из отдельных полногеномных библиотек дробовика для сборки эталонных геномов,
но формат Sanger одно чтение на образец также хорошо подходит для крупномасштабного пересеквенирования наборов генов, амплифицированных ПЦР.
для выявления вариантов (Bustamante et al. 2005; Greenman et al. 2007; Wood et al. 2007). Поскольку проточная кювета может быть разделена только на небольшое количество дорожек, и каждая секция приводит к некоторой степени потерь
ценной площади поверхности проточной кюветы, были предприняты поиски других подходов для целевого секвенирования.В принципе, высокая степень
мультиплексирования можно добиться, пометив отдельные образцы ДНК с помощью альтернативных или расширенных адаптеров во время подготовки библиотеки,
затем объединение их для секвенирования. Дополнительная последовательность представляет собой штрих-код, который позволяет сортировать считанные данные из смешанных данных в соответствии с
к образцу происхождения. Этот подход станет более привлекательным по мере увеличения длины чтения, так что доля каждого чтения
выделенная для тегов последовательность сокращена.

Подход к целевому секвенированию, который показывает большие перспективы, заключается в прямом выборе желаемых последовательностей из
сложный пул ДНК. Используя программируемый микрочип, Porreca et al. (2007) синтезировали 55000 зондов молекулярной инверсии (Hardenbol et al. 2003; Dahl et al. 2007), нацеленных на отдельные экзоны человека. Библиотеку генерировали путем гибридизации в растворе высвобожденных зондов со стриженными человеческими
гДНК, а затем секвенировали на анализаторе 1G.Были определены примерно 10 000 (28%) из 55 000 предполагаемых целей.
по крайней мере, один раз, а степень резервирования варьировалась в широких пределах. Используя еще более прямой подход, Альберт и др. (2007) гибридизировали разрезанную человеческую гДНК с микрочипами, содержащими олигонуклеотидные зонды, комплементарные любой из дисперсных коротких мишеней.
(6726 экзонов человека) или отдельные длинные геномные сегменты длиной до 5 Мбп. После захвата гДНК элюировали и секвенировали.
на GS-FLX.В зависимости от конкретного эксперимента от 65% до 77% считываний были из целевых регионов, а между
93% и 95% целей были поражены как минимум одним считыванием последовательности (со средним охватом от пяти до семи раз). Способ захвата
всех аннотированных экзонов человека на 2,1-миллионном массиве Nimblegen в настоящее время разрабатывается этой группой. Наконец, используя
аналогичная стратегия, Hodges et al. (2007) использовали серию из семи олигонуклеотидных микрочипов, чтобы попытаться захватить около 200000 экзонов человека.После элюирования захваченного
ДНК и секвенирование на анализаторе 1G эта группа сообщила, что до 98% целевых экзонов были секвенированы, а средний охват
было 1,2 раза. В зависимости от конкретного чипа от 55% до 85% захваченных и секвенированных фрагментов были из целевых областей.
Таким образом, в совокупности эти исследования показывают, что быстрое обогащение путем гибридизации олигонуклеотидов является простым и достаточно эффективным.
для создания библиотек секвенирования, обогащенных последовательностями из желаемых смежных или несмежных сегментов гДНК и
пройти долгий путь к согласованию импеданса при пробоподготовке и массовому параллельному секвенированию проточной ячейки.

Производительность и точность

Спецификации производителя для конфигурации прибора, производительности и эксплуатационных затрат (на основе предоставленных поставщиком
прейскурантные цены), действующие на момент написания этой статьи, представлены в таблице 1. Эти цифры не зависят от требований к инфраструктуре информатики.Интересно, что из-за относительно быстрого
время работы, GS-FLX по-прежнему имеет в несколько раз более высокую производительность секвенирования, чем другие платформы, измеряемые с точки зрения необработанных данных.
баз в неделю. Тем не менее, это остается самой дорогой платформой по цене ∼ 85000 долларов за Гбит / с, что более чем в 30 раз превышает ее стоимость.
других платформ. Однако важно отметить, что для всех платформ все еще есть значительный запас для увеличения
пропускная способность и снижение стоимости за Гбит / с.В принципе, наибольший прогресс может быть достигнут на платформах с одной молекулой, таких как
Helicos, где длина считывания не ограничивается дефазированием, и в проточную кювету могут быть введены матрицы из одиночных молекул.
при очень высокой плотности. Ожидается, что в будущем также будут значительно улучшены скорость и точность.
визуализации проточной кюветы, что в настоящее время является основным ограничивающим этапом для платформ, не связанных с пиросеквенированием.Поскольку инструмент
в настоящее время на выполнение пробега может уйти порядка недели, необходимо серьезно рассмотреть вопрос об амортизации оборудования.
скрытых затрат на секвенирование ДНК, особенно в этом быстро меняющемся технологическом ландшафте.

Таблица 1.

Спецификации производителя для конфигурации прибора и производства одинарных последовательностей из одной проточной кюветы

Данные последовательности, независимо от того, насколько быстро и дешево они производятся, полезны только в том случае, если они точны.Ключ к полезности высокой пропускной способности
Секвенирование по Сэнгеру — это автоматизированный метод и универсальный стандарт для определения точности: оценка phred (Ewing and Green 1998; Ewing et al. 1998). Программный пакет phred присваивает логарифмически преобразованную вероятность ошибки на основе пиковых характеристик каждому основанию в электрофореграмме.
и сохраняет эти результаты в специальном файле. phred Значения качества были важны для обрезки данных с низкой достоверностью из считываний последовательностей и значительно облегчили
обмен данными о капиллярной последовательности.Аналогичный показатель качества, позволяющий сравнивать данные из новой проточной кюветы.
Платформы секвенирования, где частота ошибок на единицу базы выше, чем при секвенировании по Сэнгеру, остается ключевой неудовлетворенной потребностью. Пока универсальный
стандарт качества желателен, он может отсутствовать в течение некоторого времени, потому что химические методы секвенирования разошлись, и каждый
есть свои проблемы, влияющие на точность. Хотя разные методы секвенирования проточной кюветы могут сообщать значения качества на одном и том же
По числовой шкале, такой как phred , эти значения качества несопоставимы для разных платформ.На данный момент наиболее надежным подходом является определение частоты ошибок.
эмпирически, путем секвенирования известного стандарта. Данные пиросеквенирования из GS-FLX обычно предварительно обрабатываются путем удаления считываний.
которые не имеют праймерной последовательности, имеют более 5% неоднозначных оснований, имеют более 3% пограничных положительных вызовов и имеют больше
чем четыре базы, выходящие за пределы нормального диапазона сигнала. Похоже, что в то время как избыточные или недопустимые значения длины гомополимера
основной источник ошибок, значительная часть ошибок пиросеквенирования связана с неправильным вызовом гранул смешанного шаблона,
а наборы данных можно легко и существенно улучшить, распознав и удалив эти проблемные операции чтения с использованием смешанных шаблонов.
(Huse et al.2007). Комплексный подход к оценке вероятности ошибки при пиросеквенировании был недавно представлен Brockman et al. (2008). Используя обучающие наборы, они эмпирически определили предикторы ошибок для отдельных баз (например, ошибочные вызовы и пере- или заниженные вызовы).
длины гомополимера), а также влияние на основную ошибку свойств считываемого изображения в целом (например, количество гомополимеров
для всего чтения, наблюдаемый шум для всего чтения и положение основания в считывании).Затем был использован алгоритм phred , чтобы интегрировать эти источники ошибок в вероятность ошибки для каждой базы. Это программное обеспечение публично
доступны (Brockman et al. 2008) и должны оказаться весьма полезными при обработке данных пиросеквенирования.

Платформа Illumina реализовала схему звонков с четырьмя значениями на базовое качество, чтобы сообщать об относительной вероятности того, что
заданная база — это A, G, C или T.Наивысшее значение указывает на наиболее вероятную базу. Как и в случае с phred , вызовы выполняются в соответствии с характеристиками чтения, а значения сообщаются в шкале с логарифмическим преобразованием. Для практических целей
когда верхний базовый балл Illumina больше примерно 15, он по существу эквивалентен баллу phred . Важным моментом является текущая необходимость создания модели ошибок для каждого прогона с использованием обучающего набора. Тренировка
set может быть фактическими данными выполнения, если цель известна, или может быть какой-либо другой известной целью секвенирования, выполняемой в одном из потоков
сотовые полосы специально для калибровки.Поскольку платформа Illumina использует четырехцветную флуоресценцию, матрица
также требуется калибровка для коррекции спектрального перекрытия, и это можно сделать с использованием того же образца, который используется для генерации
модель ошибки. В нашем центре мы сочли полезным следовать рекомендуемой процедуре включения одной полосы
бактериофаг phiX174 на каждой проточной кювете. Основываясь на 56 дорожках 27-тактных прогонов phiX174, мы наблюдаем частоту ошибок на базу
Платформа Illumina должна быть 1.3 ± 0,9%, что немного лучше, чем указанная производителем точность 98,5% на базовую точность.
Понятно, что количество ошибок начинает резко возрастать к концу чтения, и, следовательно, проверка качества чтения
обрезка желательна для многих приложений. Однако, в зависимости от строгости, качественная обрезка может привести к выбрасыванию
большая часть данных. Helicos самоотчетов с точностью> 99% для HeliScope и ABI> 99.9% за СОЛИД, а потому что
Эти платформы еще не получили широкого распространения, их точность и требования к калибровке ждут критической оценки.
Учитывая, что протоколы секвенирования обеих этих платформ включают проверку ошибок (повторное упорядочение шаблона и двухбазовое кодирование,
соответственно) ожидания должны быть высокими. Инструмент Illumina также может быть запущен дважды на одних и тех же кластерах для улучшения
частота ошибок.

Обработка данных

С возможностью секвенирования большего количества ДНК за неделю, чем многие крупные центры секвенирования, созданные за год с использованием капиллярных
секвенирования, многим лабораториям может быстро не хватать соответствующего вычислительного оборудования и опыта для обработки
и разбираться в данных, которые они генерируют.Действительно, любая из этих новых машин, работающая на полную мощность в течение года.
будет генерировать в необработанной ДНК большую последовательность, чем существовало во всем Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) — GenBank
базы данных в начале 2008 г. Анализ данных последовательности быстро стал ограничивающим шагом и, вероятно, станет
самая дорогая часть. Огромный объем данных создает проблемы при обработке, организации сети, хранении и анализе.
изображений проточной кюветы просто для того, чтобы обеспечить начальный вызов базы.Хотя некоторые производители, такие как Illumina, в настоящее время полагаются на
о существовании лабораторных компьютерных ресурсов для обеспечения последующей обработки, других инструментов, таких как SOLiD
и HeliScope предоставляют для этой цели значительные выделенные дисковые и компьютерные ресурсы. Исторически геномное секвенирование
Центры решили архивировать, по крайней мере, данные хроматограмм, полученные с помощью машин для капиллярного секвенирования. Хранение 0,5–1
терабайты необработанных данных изображения из каждого цикла секвенирования ДНК следующего поколения вряд ли будут полезны или действительно
практично, когда стоимость долгосрочного физического хранения будет близка к стоимости восстановления самих данных последовательности.

Для эффективного архивирования и обмена большими наборами данных, созданными новейшими секвенсорами, важно стандартизировать
форматы данных. NCBI уже создала предварительный архив краткого чтения или SRA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra), цель которого — обеспечить центральный репозиторий для представления, хранения и поиска коротких последовательностей. На момент написания этой статьи
архив содержит 235 представлений, все, кроме двух, содержат 454 данных.Выходя за рамки понятия капиллярного секвенирования
чтения, вторичный анализ, такой как сборки и выравнивание, будет обрабатываться SRA, как и обширные метаданные, связанные с
к, например, подробным сведениям о группе исследователей, платформе секвенирования, образцам, библиотекам и экспериментам, которые
сгенерировал данные. В настоящее время SRA принимает данные в формате ZTR, который изначально был разработан для хранения ABI.
файлы трассировки.Однако новый унифицированный формат последовательностей ДНК под названием SSR (Short Sequence Read) совместим с принципами
SRA разрабатывается сообществом биоинформатиков (http://srf.sourceforge.net/). Файлы SSR не зависят от технологии секвенирования и будут поддерживать отдельные чтения и наборы множественных чтений без
необходимость связанных данных изображения.

Использование данных

После создания данные последовательности необходимо будет либо сравнить с эталонным геномом, либо использовать для сборки последовательности de-novo.Программные подходы для эффективного достижения этой цели все еще находятся в зачаточном состоянии, и сопоставление миллионов коротких последовательностей
к эталонному геному представляет собой вычислительную проблему. Популярная программа выравнивания ДНК BLAST, например, с использованием по умолчанию
Чтобы согласовать 40 миллионов считываний пар оснований из 36 пар оснований, типичных для полного прогона проточной кюветы, с геномом человека, потребуется около 12 лет.
если вычислено на одном процессоре. Очевидно, что необходимо использовать более эффективные алгоритмы выравнивания и несколько компьютеров.Выравниватели
подходящие для этой задачи составления карты включают Maq, Eland и Exonerate (Illumina) (Slater and Birney 2005). Большинство подходов получают необходимое увеличение скорости за счет определения выравнивания без пропусков и, следовательно, выравнивания
будут слепы к присутствию небольших делеций и вставок пар оснований. И Exonerate, и коммерческий алгоритм выравнивания
SXOligoSearch (Synamatix) действительно дает возможность идентифицировать вставки и удаления.Использование зазоров совмещения с такими
короткие последовательности без консервативных штрафов за открытие пробелов и удлинение в отношении генома размером с млекопитающее, вероятно, будут генерировать
слишком много ложных срабатываний и неоднозначных отображений, чтобы быть полезными. Однако подходы к секвенированию парных концов, когда один конец может быть
однозначно закрепленный, позволяющий выравнивать другое чтение с промежутками, может оказаться полезным. Следует подчеркнуть, что полная
повторное секвенирование генома млекопитающих по-прежнему представляет собой сложную и дорогостоящую задачу, учитывая, что для этой цели необходимо
эффективный размер генома человека составляет 6 Гб, а не 3 Гб гаплоидной эталонной последовательности.Для текущего поколения
машины, 15-20-кратное покрытие, необходимое для генома человека, изолировало бы машину на большую часть года, выделенный
используйте то, что, вероятно, рассмотрит несколько лабораторий по секвенированию, независимо от стоимости реагентов.

Несколько неожиданным первоначальным применением новой технологии секвенирования стало определение характеристик хроматина, подвергнутого иммунопреципитации.
ДНК.Успех этого приложения с технологией частично объясняется тем фактом, что оно гораздо менее зависимо.
от качества последовательностей или сложного выравнивания последовательностей. Пока может быть достигнуто однозначное сопоставление с геномом,
чтение последовательности может вносить вклад в профиль взаимодействия ДНК-белок в масштабе всего генома. Проведены успешные исследования.
как для факторов транскрипции (Johnson et al. 2007; Robertson et al. 2007), так и для модификаций гистонов (Barski et al.2007; Mikkelsen et al. 2007). Также ожидается, что простая возможность однозначного сопоставления считываний последовательностей предоставит средства для характеристики транскриптомов.
а также геномные перестройки, такие как инверсии и делеции, особенно там, где используются методы парного секвенирования.

Сборка

De-novo — привлекательное приложение для секвенирования проточной кюветы, но сложное для платформ с коротким считыванием.Признано, что контиг, точно собранный из коротких чтений, может быть полезным и экономичным заменителем одиночного
Сэнгер читает во многих приложениях. Уже опубликовано шесть различных алгоритмов короткочитаемой сборки и многое другое.
находятся в стадии разработки. Первые программы, SSAKE (Уоррен и др. 2007), VCAKE (Джек и др. 2007), SHRAP (Сандквист и др. 2007) и SHARCGS (Дом и др. 2007), все используют консервативные подходы к семейству и расширению, с модификации для уменьшения ошибок при удлинении контигов либо за счет
использование информации о глубине последовательности (Jeck et al.2007) или путем выявления неоднозначностей между перекрывающимися считываниями, которые являются кандидатами на расширение контигов (Dohm et al. 2007). Самые последние программы, Edena (Hernandez et al. 2008) и ALLPATHS (Butler et al. 2008), используют другой подход и собирают короткие чтения, вычисляя граф перекрытия. Все эти сборщики уже умеют строить
точные контиги для бактериальных геномов длиной порядка 10 т.п.н., а также разработка протоколов парных концов
обещает радикально улучшить полезность таких подходов к секвенированию для сборок de-novo.В настоящее время неизвестно
точность определения концов из подходов Illumina, ABI и Helicos, где субстраты последовательностей распределены случайным образом
на проточной ячейке. Даже небольшая частота ошибок при назначении пар последовательностей может быть достаточно запутанной для текущего
поколение ассемблеров, требующих новых алгоритмов, способных обрабатывать более мягкие назначения пар сопряжения. Пиросеквенирование 454 с более длинным считыванием
Система оказалась особенно успешной для сборки de novo (Goldberg et al.2006; Hofreuter et al. 2006; Hiller et al. 2007; Пирсон и др. 2007; Smith et al. 2007). Очевидно, что возможности платформы 454 еще больше улучшились с недавним введением более длинных (> 200 п.н.) чтений.
протоколы считывания парных концов, причем последний эффективен при обнаружении структурных вариаций в геноме человека (Korbel et al. 2007). Ознакомление с данными также показало, что строгая фильтрация качества последовательности может обеспечить значительные улучшения.
по качеству сборки (Huse et al.2007), указывая на то, что устранение ошибочных чтений, даже за счет удаления значительного числа хороших чтений, может быть
полезен при сборке.

Выводы

Секвенсоры

на основе проточных кювет теперь возрождают сферу секвенирования ДНК, обеспечивая возможности для множества новых приложений.
включая глубокую характеристику иммунопреципитированной ДНК и транскрибируемых последовательностей.Хотя полный вывод
геномы бактерий и грибов теперь становятся чрезвычайно управляемыми, при текущей пропускной способности секвенирования и длине считывания поколение,
de novo, высококачественного генома размером с млекопитающее остается далеко не тривиальным. Мы неизбежно увидим больше индивидуальных геномов человека
секвенирование (Levy et al. 2007; Qiu and Hayden 2008), но связанные с этим затраты как на реагенты, так и на машинное время гарантируют, что такое секвенирование останется в исследовании
в течение некоторого времени, и перспектива создания геномов для персонализированной медицины останется далекой целью.Пока ждем возможностей
для улучшения и снижения затрат, технологий, которые позволяют выбирать и обогащать конкретные целевые последовательности, такие как
как экзоны, будут иметь первостепенное значение и будут представлять собой очень активную область исследований как в академической, так и в коммерческой сферах.
домены.

Благодарности

р.A.H. и S.J.M.J. являются учеными Фонда Майкла Смита по исследованиям в области здравоохранения. Благодарим представителей 454, ABI, Illumina,
и Helicos за оперативное предоставление текущих и официальных спецификаций приборов. Мы также благодарим Мартина Херста и Габора Марта.
за полезное обсуждение рукописи.

Проточные кюветы | Хамамацу Фотоникс

Этот веб-сайт или его сторонние инструменты используют файлы cookie, которые необходимы для его функционирования и необходимы для достижения целей, проиллюстрированных в настоящей политике использования файлов cookie.Закрыв баннер с предупреждением о файлах cookie, прокручивая страницу, щелкая ссылку или продолжая просмотр иным образом, вы соглашаетесь на использование файлов cookie.

Hamamatsu использует файлы cookie, чтобы сделать ваше пребывание на нашем веб-сайте более удобным и обеспечить его функционирование.

Вы можете посетить эту страницу в любое время, чтобы узнать больше о файлах cookie, получить самую последнюю информацию о том, как мы используем файлы cookie, и управлять настройками файлов cookie. Мы не будем использовать файлы cookie для каких-либо целей, кроме указанных, но обратите внимание, что мы оставляем за собой право обновлять наши файлы cookie.

Чтобы современные веб-сайты работали в соответствии с ожиданиями посетителей, им необходимо собрать определенную базовую информацию о посетителях. Для этого сайт создает небольшие текстовые файлы, которые размещаются на устройствах посетителей (компьютерных или мобильных) — эти файлы известны как файлы cookie, когда вы заходите на сайт. Файлы cookie используются для обеспечения функциональности и эффективности веб-сайтов. Файлы cookie уникально назначаются каждому посетителю и могут быть прочитаны только веб-сервером в домене, который отправил файл cookie посетителю.Файлы cookie не могут использоваться для запуска программ или доставки вирусов на устройство посетителя.

Файлы cookie

выполняют различные функции, которые делают работу в Интернете более удобной и интерактивной. Например, файлы cookie используются для запоминания предпочтений посетителей на сайтах, которые они часто посещают, для запоминания языковых предпочтений и для более эффективной навигации между страницами. Большая часть, хотя и не все, собранные данные являются анонимными, хотя некоторые из них предназначены для выявления шаблонов просмотра и приблизительного географического местоположения, чтобы улучшить впечатления посетителей.

Для определенных типов файлов cookie может потребоваться согласие субъекта данных перед их сохранением на компьютере.

2. Какие бывают типы файлов cookie?

Этот веб-сайт использует два типа файлов cookie:

1. Основные файлы cookie. Для нашего веб-сайта основные файлы cookie контролируются и обслуживаются Hamamatsu. Никакие другие стороны не имеют доступа к этим файлам cookie.
2. Сторонние файлы cookie. Эти файлы cookie реализуются организациями за пределами Хамамацу. У нас нет доступа к данным в этих файлах cookie, но мы используем эти файлы cookie, чтобы улучшить общее впечатление от веб-сайта.

3. Как мы используем файлы cookie?

Этот веб-сайт использует файлы cookie для следующих целей:

1. Для работы нашего веб-сайта необходимы определенные файлы cookie. Это строго необходимые файлы cookie, которые необходимы для обеспечения доступа к веб-сайту, поддержки навигации или предоставления соответствующего контента.Эти файлы cookie направляют вас в нужную страну и поддерживают безопасность и электронную торговлю. Строго необходимые файлы cookie также обеспечивают соблюдение ваших настроек конфиденциальности. Без этих строго необходимых файлов cookie большая часть нашего веб-сайта не будет работать.

Файлы cookie

2. Analytics используются для отслеживания использования веб-сайта. Эти данные позволяют нам улучшить удобство использования, производительность и администрирование нашего веб-сайта. В наших аналитических файлах cookie мы не храним никакой личной идентифицирующей информации.
3. Функциональные файлы cookie.Они используются, чтобы узнать вас, когда вы вернетесь на наш сайт. Это позволяет нам персонализировать наш контент для вас, приветствовать вас по имени и запоминать ваши предпочтения (например, ваш выбор языка или региона).
4. Эти файлы cookie записывают ваше посещение нашего веб-сайта, страницы, которые вы посетили, и ссылки, по которым вы переходили. Мы будем использовать эту информацию, чтобы наш веб-сайт и отображаемая на нем реклама соответствовали вашим интересам. Мы также можем передавать эту информацию третьим лицам с этой целью.

Файлы cookie помогают нам помочь вам. С помощью файлов cookie мы узнаем, что важно для наших посетителей, а также разрабатываем и улучшаем контент и функциональность веб-сайта, чтобы вам было удобнее пользоваться ими. Доступ к большей части нашего веб-сайта можно получить, если файлы cookie отключены, однако некоторые функции веб-сайта могут не работать. И мы считаем, что ваши текущие и будущие посещения будут улучшены, если будут включены файлы cookie.

4. Какие файлы cookie мы используем?

Есть два способа управлять настройками файлов cookie.

1. Вы можете установить настройки файлов cookie на своем устройстве или в браузере.
2. Вы можете установить свои предпочтения в отношении файлов cookie на уровне веб-сайта.

Если вы не хотите получать файлы cookie, вы можете изменить свой браузер так, чтобы он уведомлял вас об отправке файлов cookie, или вы можете полностью отказаться от файлов cookie. Вы также можете удалить уже установленные файлы cookie.

Если вы хотите ограничить или заблокировать файлы cookie веб-браузера, установленные на вашем устройстве, вы можете сделать это в настройках своего браузера; функция справки в вашем браузере должна подсказать вам, как это сделать.Кроме того, вы можете посетить сайт www.aboutcookies.org, который содержит исчерпывающую информацию о том, как это сделать в самых разных браузерах для настольных компьютеров.

5. Что такое Интернет-теги и как мы используем их с файлами cookie?

Иногда мы можем использовать интернет-теги (также известные как теги действий, однопиксельные GIF-файлы, прозрачные GIF-файлы, невидимые GIF-файлы и GIF-файлы размером 1 на 1) на этом сайте и можем развертывать эти теги / файлы cookie через стороннего рекламного партнера. или партнер по веб-аналитике, который может находиться и хранить соответствующую информацию (включая ваш IP-адрес) в другой стране.Эти теги / файлы cookie размещаются как в онлайн-рекламе, которая приводит пользователей на этот сайт, так и на разных страницах этого сайта. Мы используем эту технологию для измерения откликов посетителей на наши сайты и эффективности наших рекламных кампаний (в том числе, сколько раз открывается страница и с какой информацией обращаются), а также для оценки использования вами этого веб-сайта. Сторонний партнер или партнер службы веб-аналитики может собирать данные о посетителях нашего и других сайтов с помощью этих интернет-тегов / файлов cookie, может составлять для нас отчеты о деятельности веб-сайта и может предоставлять дополнительные услуги, связанные с использование веб-сайта и Интернета.Они могут предоставлять такую ​​информацию другим сторонам, если это требуется по закону или если они нанимают другие стороны для обработки информации от их имени.

Если вы хотите получить дополнительную информацию о веб-тегах и файлах cookie, связанных с онлайн-рекламой, или отказаться от сбора этой информации третьими сторонами, посетите веб-сайт Network Advertising Initiative http://www.networkadvertising.org.

6. Аналитические и рекламные файлы cookie

Мы используем сторонние файлы cookie (например, Google Analytics) для отслеживания посетителей на нашем веб-сайте, для получения отчетов о том, как посетители используют веб-сайт, а также для информирования, оптимизации и показа рекламы на основе чьих-либо прошлых посещений нашего веб-сайта.

Вы можете отказаться от файлов cookie Google Analytics на веб-сайтах, предоставленных Google:

https://tools.google.com/dlpage/gaoptout?hl=en

Как предусмотрено в настоящей Политике конфиденциальности (статья 5), вы можете узнать больше о файлах cookie отказа на веб-сайте Network Advertising Initiative:

http://www.networkadvertising.org

Сообщаем вам, что в таком случае вы не сможете полностью использовать все функции нашего сайта.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г.,
  браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie
потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Многоцелевая проточная ячейка

Многоцелевая проточная кювета с направляемой волной

(MPFC) используется в тех случаях, когда датчики с прямым введением не подходят, а технологический материал не требует дополнительных гарантий, присущих проточной кювете с высокой безопасностью.Одним из основных преимуществ спектроскопии процессов в ближнем инфракрасном диапазоне является использование искробезопасных оптоволоконных кабелей для удаленного определения местоположения зонда. Хотя датчики с прямым вводом исключают петли для образцов и системы отбора проб и связанные с ними проблемы, иногда необходимо установить петли для проб из соображений безопасности, обслуживания и / или кондиционирования проб. MPFC — это удобный, компактный и прочный интерфейс для образцов, который легко установить и еще проще обслуживать. Сапфировые окна ячейки можно очистить, просто сняв заглушку для очистки, чтобы получить прямой доступ к окнам без отключения технологических линий или оптоволоконных кабелей.Этот порт для очистки представляет собой нововведение с технологией Guided Wave.

Простая, удобная в эксплуатации конструкция

Ключевыми элементами конструкции MPFC являются простые, обслуживаемые уплотнительные кольца, порт для очистки GW, высокая оптическая эффективность, соединения с скользящим соединением, готовые для кабелепровода, сапфировые окна, чистая структура потока и оптика с уплотнительным кольцом для предотвращения проникновение влаги из окружающей среды. Зонд можно разобрать на месте для обслуживания уплотнительного кольца и собрать без изменения длины оптического пути, что является важным параметром для повторяемости измерений.

Прочная конструкция

Многоцелевая проточная ячейка стандартно изготавливается из нержавеющей стали 316L, но доступна и во многих других сплавах. Необходимо указать подходящие материалы для уплотнительных колец в соответствии с вашими требованиями к химии процесса и безопасности. Обычные материалы, такие как Viton, Kalrez®, EPDM и т. Д., Легко доступны. Пожалуйста, обратитесь к соответствующим ресурсам для получения информации о температурных характеристиках различных материалов уплотнительных колец и химической совместимости с вашим процессом.

Двойное уплотнение для дополнительной безопасности

Наши многоцелевые проточные кюветы теперь имеют двойное уплотнение на сапфировом интерфейсе «окно-к-процессу».Это удваивает защиту дорогих внутренних оптических линз.

Рабочий диапазон

Многоцелевая проточная кювета работает в следующих диапазонах давления и температуры:

• Температура до 300 ° C (зависит от материала уплотнительного кольца)
• Давление до 500 фунтов на кв. Дюйм (зависит от твердомера уплотнительного кольца)
• Доступна сертифицированная версия, рассчитанная на 1000 фунтов на квадратный дюйм
• Доступны пять стандартных длин оптического пути 1, 2 , 5, 10 и 20 мм

Имеется версия с подогревом

Также доступна версия MPFC, просверленная для приема нагревающей или охлаждающей жидкости.Хотя теплообмена недостаточна для значительного воздействия на быстро текущий образец, его можно использовать для поддержания температуры предварительно кондиционированного образца.

Исключительное пропускание света

Как и другие волноводные оптические зонды, многоцелевая проточная кювета обеспечивает исключительные оптические характеристики. Обычно пиковая передача превышает 50%. Это означает больше сигнала, меньший шум измерения, что приводит к более низким пределам обнаружения.

Технические характеристики: Многофункциональная проточная ячейка (MPFC)

Название продукта	Многоцелевая проточная ячейка (MPFC)
Спектральная область	УФ, ВИД, БИК
Номер детали продукта
Материал корпуса	Нержавеющая сталь 316L (стандарт), Hastelloy B, Hastelloy C-276, титан 6A1-4V, никель 200, монель (никель 400, Carpenter 20, нержавеющая сталь 316, тантал, нержавеющая сталь 304
Кабельное соединение	3/4 ”MNPT
Окончание волокна	SMA 905
Максимальное давление	500 фунтов на кв. Дюйм [3450 кПа]
Максимальная температура	300 ° C (в зависимости от материала уплотнительного кольца)
Оптическая эффективность	> 45% (800 — 1650 нм)
Материал уплотнительного кольца	Витон, EPDM, Kalrez, кремний, Доступны другие материалы
Размер расходной трубки с длиной оптического пути	Трубка с внешним диаметром 1 мм / 3/8 дюйма, трубка с внешним диаметром 2 мм / 3/8 дюйма, трубка с внешним диаметром 5 мм / 3/8 дюйма, трубка с внешним диаметром 10 мм / 1/2 дюйма, 20 трубка с НД мм / 1 ”
Спектральный диапазон	VIS-NIR (400-2100 нм), UV-VIS (200-850 нм)
Материал окна	Сапфир (Vis-NIR) или плавленый кварц (УФ)

Проточные кюветы Starna

для спектрофотометров

Проточные кюветы Starna для спектрофотометров

Проточные кюветы Starna для спектрофотометров

Проточные кюветы используются для измерения образцов в непрерывном потоке, например, при хроматографии или оперативном мониторинге производства, например, при растворении таблеток.Их также можно использовать в сипперных системах, где отдельные образцы всасываются в ячейку и из нее либо с помощью шприца, либо с помощью насосной системы. Доступно большое количество различных конструкций проточных кювет, поскольку для различных приложений требуется оптимизация доступности пробы за счет ограничения объема пробы; геометрия балки; характеристики потока и длина пути. К приборам также предъявляются различные требования к соединению трубок в зависимости от используемой насосной системы. Ассортимент производимых нами проточных ячеек обширен, чтобы учесть вышеупомянутые варианты, поэтому мы приложили все усилия, чтобы упростить процесс выбора.Если у вас есть какие-либо вопросы технического или иного характера, напишите нам или позвоните нам, и мы оперативно ответим на ваши вопросы.

Тип ячейки	световой путь 10 мм образец объема	Трубное соединение	Диафрагма Геометрия	Причина использования этого типа ячейки
Входные и выходные порты в верхней части ячейки, вставные соединители для трубок
Тип 71	3,0 мл	Нажимной	прямоугольный	Максимальный размер температуры
Тип 72	1.8 мл	Нажимной	прямоугольный	Максимальная температура, нижний объем
Входные и выходные отверстия в верхней части ячейки, резьбовые соединители для трубок
Тип 583.4	0,450 мл	M6 Резьба	прямоугольный	Хорошая проточная кювета общего назначения
Тип 583.4.14	0,560 мл	M6 Резьба	прямоугольный	Стандартный проем, высокое окно
Тип 583.65	0,720 мл	M6 Резьба	прямоугольный	Широкая диафрагма, для больших световых лучей
Тип 583.65.65	0,420 мл	M6 Резьба	Квадрат	Широкая апертура, укороченная камера для образцов
Тип 584.4	н / д	M6 Резьба	прямоугольный	Узкая высокая апертура, оптимизированная для коротких путей
Тип 583.4,14	0,560 мл	M6 Резьба	прямоугольный	Стандартная диафрагма, оптимизированная для небольших объемов
Тип 585	от 0,008 до 0,070 мл	M6 Резьба	Циркуляр	Проточные кюветы очень малого объема
Впускная трубка внизу ячейки, выпускная труба вверху, вставные соединители для трубок
Тип 46	4 мл	Нажимной	прямоугольный	Линейная проточная ячейка снизу вверх
Тип 47	1.6 мл	Нажимной	прямоугольный	Линейная проточная ячейка снизу вверх, меньший объем
Тип 47B	1,6 мл	Нажимной	прямоугольный	Линейная проточная ячейка снизу вверх, меньший объем, сам маскирующаяся
Впускные / выпускные трубки на одном окне, параллельно световому лучу, вставные соединители для трубок
Тип 48	н / д	Нажимной	прямоугольный	Линейные, короткие пути входа / выхода, параллельные световому лучу

Starna Cells, Inc PO Box 1919, Atascadero, CA 93423 USA
Телефон: 805-466-8855 Факс: 805-461-1575 электронная почта: sales @ starnacells.com

Микрожидкостная проточная ячейка с пассивным контролем потока для микроскопии

Abstract

Мы представляем быстрый, недорогой и надежный метод создания тонких, оптически прозрачных проточных ячеек с управлением потоком без насоса. Используя слои стекла, узорчатую липкую ленту и соединения из полидиметилсилоксана (ПДМС), мы демонстрируем изготовление планарных устройств с высотой камеры всего 25 мкм и размерами в миллиметрах (x, y) для наблюдения в широкоугольном микроскопе.Этот метод основан на простом настольном оборудовании и не требует оборудования для микрообработки, сверления стекла или другой инфраструктуры мастерской. Мы также описываем систему гравитационной перфузии, которая использует сильное капиллярное действие в проточной камере в качестве пассивного ограничительного клапана. Наш подход обеспечивает простую последовательную замену образцов с контролируемыми расходами, размером камеры для образцов менее 5 мкл и нулевым мертвым объемом. Мы демонстрируем систему в эксперименте по силовой спектроскопии одиночных молекул с помощью магнитного пинцета.

Образец цитирования: Bell NAW, Molloy JE (2020) Микрожидкостная проточная ячейка с пассивным контролем потока для приложений микроскопии. PLoS ONE 15 (12):
e0244103.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0244103

Редактор: Ji Yi, Бостонский медицинский центр, Школа медицины Бостонского университета, США

Поступила: 24 августа 2020 г .; Дата принятия: 2 декабря 2020 г .; Опубликовано: 15 декабря 2020 г.

Авторские права: © 2020 Bell, Molloy.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: NAWB было поддержано совместным грантом AstraZeneca-Crick (FC001632), а также Институтом Фрэнсиса Крика, который получает основное финансирование от CRUK (FC001119), MRC (FC001119) и Wellcome Trust (FC001119).У спонсоров не было никакой дополнительной роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, решении опубликовать или подготовке рукописи. AstraZeneca предоставила поддержку в виде финансирования исследования и заработной платы автору [NAWB]. AstraZeneca рассмотрела окончательный вариант документа и утвердила его представление без поправок. Конкретные роли NAWB сформулированы в разделе «Авторский вклад».

Конкурирующие интересы: AstraZeneca внесла свой вклад в финансирование этого проекта и выплату заработной платы NAWB.Это не влияет на нашу приверженность политике PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами. Авторы не заявляют о других конкурирующих интересах.

Введение

Разработка простых и высокопроизводительных методов обработки жидкостей важна для многих приложений в микроскопии и биотехнологии. В частности, для анализов in vitro и , таких как исследования отдельных молекул, требуются методы для обмена буферными растворами при контролируемой скорости потока. Для изготовления жидкостных устройств, которые могут выполнять эту задачу, был разработан широкий спектр подходов, начиная от высокоточных, литографически разработанных микрофлюидических устройств PDMS или стеклянных микропроцессорных устройств до проточных ячеек, сформированных простым склеиванием покровных стекол с помощью парафильма [1–10] .Тонкая геометрия проточной ячейки дополнительно необходима для приложений, в которых оптика с высокой числовой апертурой (NA) сочетается с экспериментальными форматами, которые требуют размещения нескольких компонентов в непосредственной близости от образца. Например, светопольные микроскопы высокого разрешения и флуоресцентные микроскопы 4Pi [11, 12] и исследования силовой спектроскопии с использованием магнитного пинцета, где полюсные наконечники должны приближаться к образцу [13, 14].

Здесь мы демонстрируем недорогую систему управления потоком без насоса в тонких жидкостных устройствах, изготовленных с использованием стандартных покровных стекол микроскопа и липкой ленты в сочетании с выпускным коллектором PDMS для соединения с трубкой.Для этого метода требуется только простое настольное устройство без необходимости сверления стекла, сложной механической обработки или литографии. Мы покажем, как сильные капиллярные силы в таких тонких стеклянных устройствах могут быть использованы для создания ограничительного клапана, который обеспечивает последовательную замену образцов. Мы описываем конструкцию однопоточных и многопоточных устройств и демонстрируем повторяемый и стабильный поток раствора в методе силовой спектроскопии одиночных молекул.

Результаты

Принципы проектирования устройства

Сборка устройства выполняется в несколько этапов, как показано на рис. 1.Подробный список материалов, которые мы использовали для различных компонентов, приведен в разделе «Материалы и методы» в конце статьи. Сначала каналы нарезаются на двусторонний скотч. В зависимости от требуемой толщины канала могут использоваться разные ленты. Каналы в ленте можно сделать либо вручную с помощью лезвия скальпеля, либо, предпочтительно, с помощью недорогой программируемой режущей машины (например, Cricut Explore) или лазерного резака, которые позволяют создавать сложные конструкции с воспроизводимым способом.Для наглядности мы показываем простое одноканальное устройство. После создания канала лента прикрепляется к более короткому верхнему покровному стеклу (рис. 1А). Любые выступающие края ленты обрезаются с помощью лезвия скальпеля, и покровное стекло выравнивается и прижимается к более длинному нижнему покровному стеклу (рис. 1B). На этом этапе два покровных стекла следует поместить на плоскую поверхность, чтобы можно было приложить равномерное давление, чтобы обеспечить хорошее уплотнение по всей ширине ленты, оставляя пустой канал, который проходит по всей длине верхнего покровного стекла.

Рис. 1. Рабочий процесс изготовления и экспериментальная установка.

(A-H) Этапы изготовления проточной ячейки. Шаги выполняются слева направо в два ряда. (I) Поперечное сечение по оси канала. Схема в масштабе для ширины канала 1,5 мм, толщины ленты 81 мкм и № Покровные стекла толщиной 1. (J) Поперечное сечение стороны готового устройства, показывающее нижнее и верхнее покровные стекла, барьер PDMS, образующий вход, и соединитель PDMS, используемый для выпускной трубки. (K) Экспериментальная установка для перфузии под действием силы тяжести.Устройство закреплено на ступени (x, y) с помощью зажимов ступени, а выпускная трубка ведет к большому резервуару, расположенному на регулируемой по высоте платформе. Скорость потока регулируется путем изменения высоты между входным и выходным резервуарами или путем изменения гидравлического сопротивления системы путем регулировки геометрии проточной ячейки и трубопровода.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0244103.g001

Затем создается соединение трубок на выпускном конце с помощью комбинации двусторонней клейкой ленты и PDMS.Отрезают небольшой участок двусторонней ленты (~ 5 мм x 6 мм) и проделывают центральное круглое отверстие с помощью пробойника для биопсии диаметром 1,5 мм. Используемая здесь лента должна иметь клей на основе силикона, чтобы обеспечить хорошее уплотнение с PDMS. Лента аккуратно размещается так, чтобы центральное отверстие просто перекрывалось выходным портом канала проточной кюветы (рис. 1C). Это обеспечивает плавный поток между каналом и трубкой в ​​готовом устройстве и, следовательно, снижает вероятность образования пузырьков воздуха [15]. Подставка с увеличительным стеклом или микроскоп для препарирования облегчает совмещение с выходным отверстием.Воздушный зазор, образованный на стыке между лентой и верхним покровным стеклом, заполняется путем добавления небольшого количества неотвержденной смеси ПДМС с обоих концов воздушного зазора, позволяя ПДМС проникать и герметизировать воздушный зазор (рис. 1D). Этот этап требует тщательного выбора времени, чтобы убедиться, что PDMS не попадает в канал. Чтобы снизить скорость потока ПДМС, он помогает частично полимеризовать ПДМС, нагревая его в течение 4 минут при 80 ° C, что увеличивает его вязкость. Когда ПДМС достигает края отверстия, его окончательно отверждают, помещая устройство на горячую плиту на две минуты при 100 ° C.

Часть (~ 5 мм x 6 мм) отвержденного PDMS вырезают скальпелем из предварительно залитого листа толщиной 4 мм и оставляют для отверждения в пластиковой чашке Петри. Затем прокалывают центральное круглое отверстие с помощью пробойника для биопсии диаметром 1,5 мм. Затем блок PDMS размещается так, чтобы центральное отверстие совпадало с соответствующим отверстием на двусторонней ленте, наклеенной на выходное отверстие (рис. 1E). Блок PDMS фиксируется на месте путем приложения равномерного давления с проточной ячейкой, лежащей на твердой плоской поверхности.Те же шаги (рис. 1C – 1E) можно выполнить на входе в канал, чтобы сформировать еще одно соединение для трубки. В качестве альтернативы, как показано на рис. 1F, PDMS можно вручную окрашивать и отверждать вокруг конца канала, чтобы сформировать гидрофобный барьер для жидкости. Этого легко добиться без попадания ПДМС во впускное отверстие, поскольку небольшое количество ПДМС, нанесенного на верхнее покровное стекло, будет течь к границе его края, но не перетекать через край из-за поверхностного натяжения. Этот метод позволяет уменьшить мертвый объем и, как будет показано на рисунках 2 и 4, создает удобный метод пассивного управления потоком в сочетании с перфузией под действием силы тяжести.Метод ручной окраски (рис. 1F) позволяет использовать входной резервуар размером ~ 30 мкл. Для экспериментов, требующих резервуаров для образцов большего размера, например, когда требуются долгосрочные высокие скорости потока, просто использовать PDMS для прикрепления небольшого резервуара, например, сделанного из большого конца пластикового наконечника пипетки. На выходе трубка соответствующего диаметра может быть вставлена ​​путем запрессовки в отверстие в блоке PDMS для образования плотного уплотнения (рис. 1G).

Рис. 2. Простая последовательная замена растворов с пассивной остановкой за счет капиллярного действия.

(A) Аппарат для создания потока под действием силы тяжести. (B) Устройство было заполнено раствором пурпурного красителя, чтобы показать канал. Выпускная трубка соединяется с выпускным резервуаром на 4 см ниже уровня впускного отверстия. (C) 10 мкл раствора зеленого красителя добавляют во впускное отверстие с помощью пипетки. (D) Раствор протекает через устройство до тех пор, пока (E) раствор не достигает входа и пассивно останавливается без участия экспериментатора.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0244103.g002

На рис. 1H показана готовая компоновка устройства, а на рис. 1I и 1J показаны поперечные сечения устройства.На рис. 1К мы показываем устройство на типичной установке микроскопа. Нижнее покровное стекло фиксируется зажимами предметного столика, а выпускная трубка ведет к широкому резервуару для жидкости, например к чашке Петри. Расход Q определяется выражением
(1)
где ρ — плотность жидкости, g — ускорение свободного падения, Δh — разница высот между входным и выходным уровнями, а R _Fluid — полное гидравлическое сопротивление устройства. Для расчета гидравлического сопротивления важно определить, является ли поток ламинарным.Характеристики потока жидкости в канале, т.е. ламинарный или турбулентный поток, можно определить путем вычисления числа Рейнольдса (Re) — безразмерной величины, которая дает отношение сил инерции к силам вязкости:
(2)
где v — скорость жидкости, l — характерный масштаб длины системы, ρ — плотность раствора, η — динамическая вязкость. В наших экспериментах даже при самых высоких используемых скоростях потока (см. Рис. 4) число Рейнольдса значительно меньше 2000 — приблизительной точки перехода между ламинарным и турбулентным потоками [16].Например, при v = 30 мм.с ^-1 , l = 0,1 мм, ρ = 1000 кг.м ^-3 , η = 0,001 Па.с значение Re = 3. Общее гидравлическое сопротивление устройства составляет затем определяется размерами канала и НКТ и дается по [17]
(3)
где L — длина трубы, d — диаметр трубы, a — длина канала, b — высота канала, w — ширина канала.

Выбирая размеры трубки и канала, можно достичь желаемой скорости потока. Мы также используем регулируемую платформу, чтобы разница в высоте между входным и выходным уровнями резервуара, Δh, позволяла контролировать скорость потока в полезном диапазоне во время эксперимента.Обычно мы используем акриловую ленту толщиной 81 мкм для проточного канала вместе с покровными стеклами № 1, в результате чего общая толщина устройства составляет ~ 380 мкм. Минимальная толщина, которую мы достигли с помощью клейкой ленты для переноса толщиной 25 мкм в сочетании с покровными стеклами класса 0, составляет всего ~ 250 мкм.

Регулирование потока с помощью капиллярных сил

Использование стекла для верхнего и нижнего слоев устройства вместе с высотой канала менее 200 мкм создает сильные капиллярные силы, действующие в канале.Если это капиллярное действие больше, чем движущая сила гравитационной подачи, тогда, когда входной резервуар будет исчерпан, поток раствора прекратится, но канал останется заполненным раствором. Простая модель предсказывает максимальную высоту Δh между входным и выходным уровнями резервуара, при которой капиллярное действие может предотвратить продолжение потока за пределами входа: давление Лапласа, ΔP, на границе раздела между жидкостью в капилляре и воздухом для геометрия параллельных пластин задается формулой
(4)
где γ — поверхностное натяжение, θ — угол смачивания, а b — высота между двумя параллельными пластинами (в нашем случае толщина ленты).Капиллярное действие будет удерживать раствор, если. Принятие значений для воды в типовой проточной камере, где: b = 81 мкм, γ = 0 . 07 № . м ^-1 , θ = 0 ^o (, т.е. полное смачивание), ρ = 1000 кг.м ^-3 , g = 10 мс ^-2 предсказывает, что система будет пассивно останавливаться до тех пор, пока Δh ≤ 17,5 см. На практике мы измерили предельную высоту, равную Δh ~ 11 см для деионизированной воды, когда проточная камера была оборудована трубкой, как на рисунках 2 и 4C.Это устанавливает максимум достижимого расхода для данной геометрии устройства, когда требуется пассивная система остановки потока. Отметим, что максимальная высота для пассивного ограничителя потока масштабируется как величина, обратная высоте канала, тогда как скорость потока изменяется как куб высоты канала в соответствии с уравнением (3). Следовательно, эксперименты, требующие высокой скорости потока, выиграют от увеличения высоты канала. Однако это должно быть уравновешено другими факторами, которые способствуют меньшей высоте канала, такими как необходимость иметь небольшой объем камеры и зависимость скорости потока от времени, вызванную наличием небольшой высоты между уровнями входа и выхода (см. Следующий раздел).

На рис. 2 мы показываем основные компоненты устройства и демонстрируем механизм пассивной остановки. На рис. 2А показан вид сбоку на используемое устройство. Устройство находится на платформе над большим выпускным резервуаром. Трубка с внутренним диаметром 0,51 мм подсоединяется к коллектору PDMS устройства и действует как соединение между устройством и выходным резервуаром. На Рис. 2B – 2D показан канал потока с высоты птичьего полета. Ширина и длина канала были точно обрезаны на отрезном станке Cricut Explore Air 2, что дало габаритные размеры w = 1.5 мм, a = 22 мм, b = 81 мкм (общий объем = 2,7 мкл). Устройство было заполнено раствором пурпурного красителя (рис. 2В), а уровень выходного резервуара был установлен на высоту Δh = 4 см ниже входа. После добавления 10 мкл раствора зеленого красителя (рис. 2C) раствор протекает непрерывно (рис. 2D), пока не остановится на входе (рис. 2E). Это последовательное добавление пробы может повторяться несколько раз без образования пузырьков воздуха (видео S1) и поэтому является удобной альтернативой более сложным системам с жидкостными клапанами, которые обычно используются для переключения между растворами.Одним из потенциальных недостатков этой системы является то, что открытый вход на входе означает, что испарение приведет к небольшому остаточному потоку, поскольку раствор вытягивается к входу за счет капиллярного действия для компенсации потерь на испарение. Используя устройство с выходом, закрытым эпоксидной смолой, и открытым входом, мы измерили потери из-за испарения и составили ~ 0,5 мкл / ч ^-1 , т.е. ~ 0,1 нл ^-1 в комнате при 22 ° C и 45 ° C. % относительная влажность. Эта малая скорость обратного потока пренебрежимо мала для большинства применений и может быть дополнительно уменьшена за счет уменьшения ширины канала на входе.

Изготовление многопоточных устройств

Несколько потоков полезны в определенных приложениях, где решения должны быть разделены, но одновременно доступны на одном устройстве. Например, в экспериментах с одной молекулой метод сборки ДНК с помощью двухлучевой оптической ловушки основан на создании отдельных потоков для бусинок и ДНК [18]. Наш метод легко распространяется на изготовление устройств с множеством каналов путем программируемого обрезания двусторонней ленты. На рис. 3A показан пример конструкции, в которой четыре отдельных канала сходятся в один канал.PDMS вручную окрашивают для разделения четырех входных отверстий (рис. 3B). На рис. 3C и 3D показаны изображения собранного устройства с четырьмя отдельными красителями, используемыми для изображения потоков. Низкое число Рейнольдса создает ламинарный поток без поперечных токов, перпендикулярных оси канала, так что перемешивание в основном определяется диффузией между потоками.

Рис. 3. Многоканальное проточное устройство.

(A) Компьютерное проектирование используется для изготовления рисунка на двусторонней ленте с помощью программируемой раскройной машины.(B) Устройство собрано, как показано на рис. 1, но с барьерами PDMS для четырех отдельных входов. (C) Вид устройства с высоты птичьего полета с несколькими потоками в ламинарном потоке. (D) Увеличенное изображение, обозначенное пунктирной рамкой на (C), показывающее четыре отдельных ламинарных потока.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0244103.g003

Пример приложения для силовой спектроскопии

Чтобы продемонстрировать применение нашего метода в исследовании под микроскопом, мы использовали одноканальное устройство для эксперимента по растяжению ДНК с помощью магнитного пинцета.На рис. 4А показана схема эксперимента, в котором пара неодимовых магнитов расположена над поверхностью проточной ячейки, установленной на столике инвертированного микроскопа. Магнитные шарики прикреплены к нижнему покровному стеклу с помощью отдельных молекул ДНК (длиной 7,9 т.п.н.). Когда магниты опускаются в непосредственной близости от проточной кюветы, градиент магнитного поля заставляет шарики подниматься от поверхности покровного стекла до тех пор, пока молекулы ДНК не натянутся и не растянутся до их контурной длины, равной 2.7 мкм (рис. 4В). Когда буфер добавляется во входной резервуар, начинается поток раствора, и сопротивление Стокса шарикам заставляет их совершать маятниковые колебания вдоль направления потока, уменьшая их высоту над покровным стеклом (z-смещение). Скорость потока контролируется в режиме реального времени путем измерения положения шарика с анализом видеоизображения.

Рис. 4. Контролируемое добавление образцов в эксперименте по растяжению одной молекулы ДНК.

(A) Экспериментальная схема, показывающая проточную ячейку вместе с магнитами, расположенными в непосредственной близости от верхнего покровного стекла для приложения фиксированной силы.(B) ДНК привязана к поверхности с помощью магнитной бусины. При нулевом потоке магнитная сила действует от поверхности и растягивает ДНК. При добавлении раствора положение шарика изменяется из-за потока раствора, параллельного оси канала. (C) Z-высота валика как функция времени для устройства с использованием трубки с внутренним диаметром 20 см и 0,51 мм с гидравлическим сопротивлением, рассчитанным как 402 Па · с мкл ^-1 . Звездочки указывают моменты времени, когда 10 мкл раствора было вручную добавлено на впускное отверстие.(D) Тот же эксперимент, что и (C), после добавления 25 мм трубки с узким проходом диаметром 0,127 мм для увеличения расчетного гидравлического сопротивления до 3889 Па · с мкл ^-1 . (E) Используя устройство в той же конфигурации, что и (C) — были добавлены образцы раствора по 10 мкл, а высота между входным и выходным уровнями резервуара была изменена, как указано. (F) Сравнение расходов через устройство для двух различных конфигураций гидравлического сопротивления в зависимости от разницы высот входного и выходного резервуаров.Оранжевая линейная аппроксимация дала значение R _{для жидкости} = 3990 Па · с мкл ^-1 , а синяя линейная аппроксимация дала значение R _{для жидкости} = 366 Па · с мкл ^-1 . (G) Экспериментальная запись, показывающая добавление 10 мкл образцов раствора, разделенных интервалом ~ 1 час.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0244103.g004

Мы собрали прибор с размерами канала w = 1,5 мм, a = 22 мм, b = 81 мкм. Это было связано с 20 см 0.Трубка с внутренним диаметром 51 мм дает полное гидравлическое сопротивление (из уравнения (3) с η = 8,9×10 ^-4 Па · с) R _Fluid = 402 Па · с мкл ^-1 . На фиг. 4C показано изменение z-высоты гранул, когда 10 мкл буферного раствора (PBS + 0,2 мг / мл ^-1 BSA) вручную пипеткой наносят на вход устройства в трех временных точках. Сила, создаваемая магнитным полем, F _mag , во всех измерениях поддерживалась постоянной на уровне 7 пН. Шарик отклоняется потоком при добавлении раствора и быстро возвращается к своей исходной высоте после того, как входное отверстие опустошается.Важно отметить, что эксперимент показывает, что поток является повторяемым и стабильным с минимальным остаточным потоком. Чтобы уменьшить расход, мы добавили трубку с внутренним диаметром 0,127 мм длиной 25 мм, последовательно с трубкой с внутренним диаметром 20 см и 0,51 мм, используя простой соединитель, сделанный из блока затвердевшего PDMS толщиной 4 мм с помощью пресса. отверстие, сделанное с помощью пробойника для биопсии. Эта трубка с узким проходом существенно увеличивает (примерно в 10 раз) гидравлическое сопротивление согласно уравнению (3) для R _Fluid = 3889 Па.с. мкл ^-1 . На рис. 4D показаны изменения z-высоты гранул при добавлении трех образцов 10 мкл буферного раствора и, как и ожидалось, наблюдается существенное снижение скорости потока.

Скорость потока также можно регулировать в ограниченном диапазоне, изменяя высоту выпускного резервуара. На рис. 4E показан эксперимент, в котором высота выпускного резервуара регулировалась между добавлением пробы. Мы использовали гибкие (Tygon) трубки между выпускным отверстием канала и выпускным резервуаром, чтобы минимизировать механические воздействия на систему при изменении высоты выпускного резервуара.На рис. 4F мы количественно определяем наблюдаемую среднюю скорость потока как функцию высоты между входным и выходным резервуарами для устройства с узкой трубкой и без нее. Это показывает ожидаемую линейную зависимость, согласно уравнению (1), с аппроксимацией по методу наименьших квадратов, дающей значения сопротивления в пределах 10% от сопротивления, рассчитанного по уравнению (3). В общем, для создания постоянной скорости потока желательно иметь максимально допустимое расстояние между входным и выходным резервуарами, поскольку изменение размера капель на входе во время потока может создавать небольшую изменяющуюся во времени составляющую разницы по высоте между входом. и выпускной резервуар.Это можно наблюдать как небольшое уменьшение прогиба борта (и, следовательно, скорости потока) в процессе потока раствора — например, на рис. 4E. Эксперименты, требующие более точного управления скоростью потока, могут выиграть от добавления датчика скорости потока с пьезоэлементом с обратной связью для выходного резервуара для корректировки небольших, изменяющихся во времени различий в высоте резервуара во время потока.

Устройство обеспечивает стабильное наблюдение в течение длительных периодов времени между добавками раствора — важная предпосылка для многих рабочих процессов микроскопии.На рис. 4G показан пример эксперимента, в котором два образца раствора по 10 мкл были добавлены с интервалом времени между добавлениями приблизительно 1 час. Положение магнитного шарика оставалось неизменным между этими моментами времени, и скорость потока (как показано на момент отклонения шарика) согласовывалась. Это демонстрирует, что капиллярное действие стабильно удерживает раствор в камере без образования пузырьков воздуха, что позволяет получать данные в течение длительного времени.

Мультиплексирование и воспроизводимость потока

Чтобы продемонстрировать высокую производительность экспериментов и воспроизводимость тестового устройства, мы создали дизайн с четырьмя каналами, программно вырезанными по площади покровного стекла.Мы также программно разрезаем силиконовую переходную ленту, чтобы иметь четыре круглых отверстия для каналов вместе с пятью квадратными отверстиями, которые позволяют добавлять PDMS для герметизации каждого канала. Основные этапы сборки устройства показаны на рис. 5A – 5F. На рис. 5G показано изображение готового устройства, заполненного растворами красителей.

Рис. 5. Многоканальная конструкция и проверка воспроизводимости.

(A-E) Ключевые этапы изготовления проточной камеры. Шаги выполняются слева направо в два ряда.(F) Изображение проточной камеры, заполненной четырьмя различными растворами красителя. (G) Записи датчика потока с четырех каналов на одном устройстве. Каждый канал был заполнен деионизированной водой, и 30 мкл деионизированной воды было добавлено при t = 10 с. В начале потока есть кратковременный переходный процесс из-за жидкостной емкости устройства. (H) Значения расхода, измеренные при t = 30 с для 19 каналов на пяти устройствах (один канал был заблокирован PDMS и поэтому не измерялся).

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0244103.g005

Мы сделали пять устройств, используя эту конструкцию, и заполнили каждый канал деионизированной водой. Чтобы проверить воспроизводимость скорости потока между каналами, датчик скорости потока (Fluigent, FLU-M-D) был подключен к выпускной трубке для регистрации потока с частотой дискретизации 50 Гц, когда на вход было добавлено 30 мкл раствора деионизированной воды. Для каждого канала использовалась одна и та же трубка (см. Материалы и методы). Высота между входным и выходным резервуарами составляла Δh = 7 см.На рис. 5G показаны примеры расхода, зарегистрированного датчиком из четырех отдельных каналов на одном устройстве, когда на входе было добавлено 30 мкл деионизированной воды. На рис. 5H мы наносим на график записанный расход при t = 30 с (то есть через 20 с после добавления раствора) из 19 каналов, измеренный на пяти устройствах. Это показывает высокую воспроизводимость метода от канала к каналу со средней скоростью потока 0,60 мкл / с ^-1 и межквартильным интервалом 0,03 мкл / с ^-1 .

Обсуждение

Итак, мы представили новый метод высокопроизводительного изготовления тонких стеклянных проточных камер.Эти устройства недороги и просты в изготовлении, поскольку они не требуют сложных технологий изготовления, таких как сверление стекла или литография. Это означает, что они могут быть одноразовыми, одноразовыми, идеально подходящими для многих рабочих процессов исследовательских лабораторий. В отличие от микрофлюидики на основе литографии PDMS, наш метод позволяет создавать жесткие и ультратонкие устройства. Таким образом, эти проточные кюветы находят особое применение в исследованиях под микроскопом, которые требуют близкого доступа к образцу, например. с объективами с высокой числовой апертурой и конденсаторной оптикой или для таких методов, как магнитный и оптический пинцет.Поскольку угол смачивания воды на стекле значительно меньше, чем у воды на PDMS, использование стекла для верхнего и нижнего слоев устройства также позволяет использовать прочные капиллярные запорные клапаны. Однако разрешение (x, y) каналов, сформированных с помощью клейкой ленты, ниже, чем это возможно с помощью микрофлюидики на основе литографии. Литография PDMS стандартно позволяет использовать элементы размером до микронного уровня [19]. По нашему опыту, минимальная ширина канала, который может быть изготовлен в клейкой ленте с помощью программируемого механического режущего лезвия, составляет ~ 500 мкм.Недавняя демонстрация показала, что с помощью лазерного резака можно делать каналы в клейкой ленте шириной до ~ 100 мкм [20].

Мы также представили метод управления скоростью потока с использованием гравитационной подачи и метод последовательного добавления образцов, который использует капиллярное действие устройства для автоматической остановки потока, когда подача раствора во входном резервуаре заканчивается. Наш подход к регулированию потока с помощью капиллярного клапана имеет ряд ценных аспектов. Отсутствие трубки на впускной стороне приводит к нулевому мертвому объему, а размер камеры для образцов легко изготавливается так, чтобы он составлял <5 мкл, что важно для ценных образцов.Затраты на оборудование и опыт минимальны, поскольку не требуются клапаны, шприцевые насосы или регуляторы давления. Также существует минимальное механическое возмущение при обмене растворами, что позволяет непрерывно отслеживать такие объекты, как магнитные шарики. Эти особенности делают этот метод изготовления устройств и управления потоком полезным инструментом для микроскопических исследований.

Материалы и методы

Оборудование и расходные материалы для приборостроения

Для каналов, сделанных в ленте вручную, единственное необходимое оборудование — это нагревательная плита для отверждения PDMS при 100 ° C и подставка с увеличительным стеклом или диссекционный микроскоп для выравнивания слоев устройства.Однако предпочтительно использовать программируемую режущую машину для создания воспроизводимых конструкций, особенно для многоканальных устройств. Мы использовали аппарат Cricut Explore Air 2, который продается по цене ~ 250 долларов.

Необходимы следующие основные расходные материалы: (1) Верхнее и нижнее покровные стекла. (2) Двусторонняя лента для формирования каналов. (3) Двусторонняя лента на основе силикона для подключения PDMS. (4) ПДМС. (5) Шприц и наконечники для дозирования ПДМС и заправочного устройства. (6) Пунш для биопсии. (7) Трубки.(8) Чашка Петри для выпускного резервуара. Мы использовали следующие специальные материалы: покровные стекла (толщина № 1 и № 0) были приобретены у ThermoFisher (Menzl-Glasser). Для верхнего слоя использовали покровные стекла размером 22 мм x 22 мм, а для нижнего слоя использовали покровные стекла размером 22 мм x 50 мм. Для формирования каналов мы успешно использовали ленту на акриловой основе толщиной 81 мкм (Adhesives Research, AR

), ленту на силиконовой основе толщиной 25 мкм (Adhesives Research, AR8026) или ленту на акриловой основе толщиной 50 мкм (ThorLabs, OCA8146-2).Ленты 25 мкм и 50 мкм представляют собой так называемые клейкие ленты для переноса, которые не имеют центральной пленки, зажатой между клеем. Эти типы лент склонны к разрыву при обработке механическим резаком, а лазерный резак дает более стабильные результаты. Для ленты 81 мкм (используемой во всех устройствах, показанных в рукописи) каналы были вырезаны до заданных размеров с помощью Cricut Explore Air 2. Лента на основе силикона толщиной 140 мкм (Adhesives Research, AR

) использовалась для склеивания PDMS и стекло (рис. 1C – 1E) во всех показанных устройствах.В качестве альтернативы мы также добились успеха, используя дифференциальную клейкую двустороннюю ленту толщиной 120 мкм (Grace Bio-labs SecureSeal, GBL620001, Sigma-Aldrich) с силиконовой стороной, используемой для PDMS, и акриловой стороной, используемой для стекла. Для каналов также можно использовать ленты толщиной 140 мкм и 120 мкм. ПДМС (Sylgard 184, Dowsil) использовали при соотношении эластомер: отвердитель 10: 1. Аликвоты смешанного PDMS могут храниться при -20 ° C до месяца без отверждения для удобного предварительного приготовления.ПДМС наносили вручную (рис. 1D и 1F) с помощью пластикового шприца объемом 5 мл, наполненного смешанным ПДМС, соединенного с пластиковым наконечником пипетки или наконечниками с тупым концом ¼ ”23 га (0401-08-000094, Ellsworth Adhesives). Для пробивки отверстий в PDMS использовались пробойники для биопсии 1,5 мм (BP15F, Selles Medical) и использовались в сочетании с трубкой Tygon ND-100-80 Microbore ID = 0,02 дюйма = 0,51 мм, OD = 0,06 дюйма = 1,5 мм (Cole-Parmer) . Каждое готовое устройство сначала заполняли раствором, прикрепляя шприц Hamilton на 100 мкл к выпускной трубке с помощью наконечников с тупым концом ¼ ”23 га (0401-08-000094, Ellsworth Adhesives) и протягивая раствор вручную.Для устройства с высоким гидравлическим сопротивлением (рис. 4C) к концу трубки Tygon с помощью соединитель, сделанный путем пробивки отверстия 1,5 мм в отрезке затвердевшего PDMS толщиной 4 мм и вставки концов трубок в этот соединитель. На этапах перфорации биопсии полезно поместить подлежащий перфорации ПДМС на кусок отработанного материала ПДМС, чтобы позволить пробойнику для биопсии полностью проникнуть, не повреждая наконечник.Файлы векторной графики для различных дизайнов лент можно получить у авторов по запросу.

Магнитный пинцет

Для измерений с помощью магнитного пинцета нижнее покровное стекло было покрыто 2% коллодием (Sigma-Aldrich) методом центрифугирования. Устройство было собрано и затем покрыто антителами к дигоксигенину (Roche) перед пассивацией с помощью BlockAid (ThermoFisher). Магнитные шарики инкубировали с конструкцией ДНК, состоящей из центральной вставки размером 7,9 т.п.н. и двух «ручек» на обоих концах, сделанных с помощью ПЦР с включением нуклеотидов дигоксигенина и биотина.Магнитные шарики пропускали в устройство и инкубировали в течение пяти минут перед пропусканием через PBS (Gibco 10010–031) + 0,2 мг / мл ^-1 BSA, который фильтровали с помощью шприцевого фильтра 0,2 мкм. Положение шарика отслеживалось с помощью видеомикроскопа с использованием микроскопа Nikon TE-2000, мощного светодиодного осветителя и воздушного объектива Nikon с 60-кратным увеличением. Высота борта по оси z была рассчитана с использованием справочной таблицы для картины дифракционных колец [21]. Дрейф микроскопа был скорректирован путем вычитания положения контрольной гранулы кремнезема, которая была привязана к поверхности.Каждый добавленный раствор (рис. 4C – 4E и 4G) состоял из 10 мкл PBS + 0,2 мг / мл ^-1 BSA. Положение шарика было получено при частоте изображения 20 Гц. На рис. 4C – 4E и 4G черная кривая показывает данные с 3-точечным медианным фильтром, а красная кривая показывает 10-точечный медианный фильтр. Средняя скорость потока, показанная на фиг. 4F, была рассчитана путем определения времени отклонения шарика и деления на добавленный объем.

Измерения датчика расхода

Скорость потока измерялась для каждого канала отдельно с помощью коммерческого датчика скорости потока (Fluigent, FLU-M-D).Использовалась деионизированная вода. Та же самая комбинация последовательно соединенных трубок использовалась в каждой записи — 1,6 см Tygon ND-100-80 (ID = 0,02 дюйма, OD = 0,06 дюйма) для подключения к блоку PDMS, затем трубка PEEK диаметром 12 см (ID = 0,5 мм). , OD = 1/16 дюйма) и трубки из ПЭЭК 10,1 см (ID = 0,01 дюйма, OD = 1/32 дюйма) для подключения к датчику потока. Поскольку точные размеры датчика потока неизвестны, мы не оценили ожидаемое гидравлическое сопротивление в этом измерении.

Дополнительная информация

S1 Video.Повторная замена образца с пассивной остановкой потока.

S1 Video показывает необработанное видео, из которого созданы изображения на рис. Устройство наполняют раствором пурпурного красителя и добавляют 10 мкл раствора красителя, чередуя зеленые и пурпурные красители.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0244103.s001

(MP4)

Благодарности

Авторы благодарят Джехангира Каму за полезные обсуждения, Дэниела Бернхэма за помощь с использованием программируемого режущего устройства Cricut Explore, Грегори Машанова за программное обеспечение для магнитного пинцета и Джорджа Константину за помощь с записями датчика потока.

Ссылки

1. 1.
   Брюэр Л.Р., Бьянко ПР. Кюветы с ламинарным потоком для исследования взаимодействий ДНК-белок с помощью одной молекулы. Нат методы. 2008; 5: 517–525. pmid: 18511919
2. 2.
   Забудьте А.Л., Домбровски СС, Амитани И., Ковальчиковски СК. Изучение взаимодействий белок-ДНК в 3D с использованием in situ конструирования, манипулирования и визуализации отдельных гантелей ДНК с помощью оптических ловушек, микрофлюидики и флуоресцентной микроскопии. Nat Protoc. 2013; 8: 525–538.pmid: 23411634
3. 3.
   Xiong K, Blainey PC. Простая, надежная и высокопроизводительная реализация анализа растяжения потока одной молекулы для изучения транспорта молекул вдоль ДНК. J Vis Exp. 2017; 128: e55923. pmid: 28994817
4. 4.
   Лионнет Т., Аллеманд Дж. Ф., Ревякин А., Стрик Т. Р., Салех О. А., Бенсимон Д. и др. Конструкция магнитной ловушки. Cold Spring Harb Protoc. 2012; 7: 133–138. pmid: 22194260
5. 5.
   Ахмади А., Тилль К., Хафтинг И., Шюттпельц М., Бьёрас М., Глетте К. и др.Аддитивное производство ячеек ламинарного потока для экспериментов с одиночными молекулами. Sci Rep.2019; 9: 16784. pmid: 31727950
6. 6.
   Курсон ДС, Рок РС. Быстрое изготовление лабораторных камер с ламинарным потоком для передовых методов микроскопии. PLoS One. 2009; 4: e6479. pmid: 19649241
7. 7.
   Yardimci H, Loveland AB, van Oijen AM, Walter JC. Одномолекулярный анализ репликации ДНК в экстрактах яиц Xenopus. Методы. 2012; 57: 179–186. pmid: 22503776
8. 8.Ле С., Яо М., Чен Дж., Ефремов А.К., Азими С., Ян Дж. Быстрая замена раствора без помех для исследования одиночных молекул магнитным пинцетом. Nucleic Acids Res. 2015; 43: e113. pmid: 26007651
9. 9.
   Миллер Х., Чжоу З., Шеперд Дж., Уоллман AJM, Лик М.С. Одномолекулярные методы в биофизике: обзор прогресса в методах и приложениях. Отчеты Prog Phys. 2018; 81: 024601. pmid: 28869217
10. 10.
    Шармет Дж., Аросио П., Ноулз TPJ. Микрофлюидика для биофизики белков.J Mol Biol. 2018; 430: 565–580. pmid: 29289566
11. 11.
    Беверсдорф Дж., Шмидт Р., Ад Ю. Сравнение I5M и 4Pi-микроскопии. J Microsc. 2006. 222: 105–117. pmid: 16774519
12. 12.
    Шредер М., Козубек М., Хелл С.В., Уилсон Т. Оптические передаточные функции конфокальных микроскопов 4Pi: теория и эксперимент. Opt Lett. 1997. 22: 436–438. pmid: 18183226
13. 13.
    Липферт Дж., Хао Х, Деккер Н.Х. Количественное моделирование и оптимизация магнитных пинцетов.Биофиз Дж. 2009; 96: 5040–5049. pmid: 19527664
14. 14.
    Neuman KC, Nagy A. Одномолекулярная силовая спектроскопия: оптический пинцет, магнитный пинцет и атомно-силовая микроскопия. Нат методы. 2008; 5: 491–505. pmid: 18511917
15. 15.
    Перейро И., Фомичева Харченко А., Петрини Л., Кайгала Г. В. Прищемите пузырек в зародыше: руководство по предотвращению образования зародышей газа в микрофлюидике. Лабораторный чип. 2019; 19: 2296–2314. pmid: 31168556
16. 16.
    Гравесен П., Бранебьерг Дж., Йенсен О.Микрофлюидика — обзор. J Micromechanics Microengineering. 1993; 3: 168.
17. 17.
    Beebe DJ, Mensing GA, Walker GM. Физика и применение микрофлюидики в биологии. Annu Rev Biomed Eng. 2002; 4: 261–286. pmid: 12117759
18. 18.
    Забудьте А.Л., Ковальчиковски СК. Одномолекулярное изображение спаривания ДНК с помощью RecA выявляет трехмерный поиск гомологии. Природа. 2012; 482: 423–427. pmid: 22318518
19. 19.
    Gale BK, Jafek AR, Lambert CJ, Goenner BL, Moghimifam H, Nze UC, et al.Обзор современных методов изготовления микрофлюидных устройств и перспектив коммерциализации в будущем. Изобретения. 2018; 3: 1–25.
20. 20.
    Замора В., Маркс С., Арндт-Штауфенбиль Н., Янечка С., Хавлик Г., Кайссер М. и др. Двусторонние клейкие ленты с лазерной микроструктурой для интеграции одноразового биочипа. Ход работы. 2017; 1: 606.
21. 21.