Проверка подлинности кассеты барьер: Проверка подлинности кассет, картриджей и проточных систем БАРЬЕР

Картридж для фильтра Барьер «Жесткость Железо» (3 штуки). Эффективный сменный картридж для кувшинов Барьер

Пользуюсь фильтрами для воды уже лет двадцать. До этого бил фильтр-кувшин одной известной марки, пока она дико не подорожала. По этому перешел на марку Барьер. За все время он меня ни разу не подвел. В принципе все марки примерно похожи по составу наполнителя и действию, но Барьер мне нравится потому что картриджи на резьбе. Их удобней завинчивать чем впихивать в кувшин. И приемлемой цене. Сменные картриджи лучше покупать в большей упаковке по несколько штук (есть упаковки по две, три и четыре шт.). Так реально дешевле выгода. Раньше упаковка была в сине-белых цветах, сейчас почему-то сделали черной. Странно, по логике сине-белые цвета более ассоциируются с водой. Упаковка картонная, плотно склеена. На всех сторонах много подробной информации написано. В том числе и идентификационный код проверки подлинности. Можно вбить на сайте и проверить что вы купили не поддельный. Внутри каждый картридж запаян в индивидуальную вакуумную упаковку. С названием типа фильтрации. Пластик картриджа качественный, не пахнущий пластмассой. Ресурс одного картриджа до 350 литров воды. Хватает примерно на месяц использования. 

Информация на упаковке.

Эксплуатационные характеристики:

безопасный пластик

герметичная резьба

подходит ко всем кувшинам Барьер

технология Наноплюс ( увеличивает эффективность очистки)

Ступени очистки:

1. Кокосовый активированный уголь (удаляет побочные продукты хлорирования, улучшает вкусовые качества)

2. Кокосовый уголь, обработанный ионами серебра (предотвращает рост бактерий)

3. Смесь ионообменных смол (снижает жесткость воды, удаляет соли металлов)

4. Мембрана из специального микроволокна (удаляет ржавчину)

Степень очистки до 96-99% разных примесей в воде. Помимо жесткости эта кассета очищает и от других примесей типа активного хлора, хлороганических соединений, фенолов, пестицидов, нефтепродуктов и солей металлов.

ьььььььБеру версию картриджей для жесткой воды + железо. У меня вода из крана очень жесткая. Реально помогает. В чайнике накипи нет. Картридж держится от трех недель до месяца. Вода чистая. Качество вкуса реально высокая. Первые два-три дня пока картридж новый, есть небольшой привкус угля, но это быстро проходит. Перед использованием по инструкции нужно слить пару кувшинов, что бы вымыть из нового картриджа пыль угольную. В составе картриджа несколько систем очистки. Как написано на упаковке — выполнено по австрийской технологии BWT. Уголь кокосовый, уголь с ионами серебра (это для того чтоб обеззараживать от бактерий сам картридж внутри в процессе эксплуатации), ионообменная смола (для снятия накипи) и маленькая волокнистая пластина для удаления ржавчины. Зачем ее поставили в самый низ — вот вопрос. Условно, допустим, ржавая вода проходит через весь фильтр, забивая все его слои ржавчиной и потом только очищается  этой мембраной? Надо было поставить ее вверх. Сначала шла бы грубая очистка от примеси железа и ржавчины а потом более-менее чистая вода доочищалась бы углем. Для этого, чтобы продлить срок службы картриджа, я делаю срез с кончика и напихиваю туда немного медицинской ваты. Она дополнительно фильтрует воду и продлевает службу картриджа. Выньте ее через неделю. Она слегка пожелтеет от ржавых примесей воды. Так же я в середине срока эксплуатации вынимаю его из кувшина и промываю под струей воды с обратной стороны приставив шланг от душа к отверстию. Вымывается вся гадость которая успела накопиться в верхней части картриджа. Видно невооруженным глазом. И картридж продлит свой срок действия немного.Замерял параметры воды солемером до и после очистки. Реально видна разница. как только показатели падают — произвожу замену. Главное вовремя менять картриджи в кувшине. И чистая вода в доме обеспечена.

Сменные картриджи Barrier по лучшей цене в Киеве

Картридж к фильтру Барьер

Очистка воды дома — это удобная альтернатива доставке. Существует несколько типов фильтров для воды, который широко используются в быту. Одним из них является фильтр-кувшин Barrier. Фильтр представляет собой достаточно компактный пластиковый кувшин со специальной воронкой, которая вмещает воронку со сменным картриджем и крышку.

Самым главным элементом отвечающим з качество воды является сменный картридж Барьер цена которого и определяет стоимость очистки воды. В данной категории вы можете найти подходящий вам картридж для фильтра Барьер.

Как работают сменные картриджи барьер?

В основе конструкции картриджа лежит стакан из пищевого пластика с отверстиями в нижней части. На дне этого стакана размещается слой фильтровальной ткани. Над ней расположен слой кокосового активированного угля, который обеспечивает удаление хлора и органических веществ, в том числе канцерогенной хлорорганики путем сорбции. Выше идет слой угля обработанного ионами серебра. Этот уголь обеспечивает предупреждение биологических обрастаний внутри сменного фильтра.

Выше идет слой ионообменных смол, которые обменивают вредные ионы в проточной воде на безопасные, тем самым обеспечивают удаление солей жесткости и тяжелых металлов.

Какой можно купить картридж для воды Барьер?

В нашем ассортименте можно найти три типа таких картриджей, которые несколько отличаются пропорциями фильтрующих материалов в загрузке.

• картридж Барьер Стандарт для относительно чистой водопроводной воды. Обеспечивает удаление хлора, снижение цветности и запахов воды, а также частично снижает жесткость;
• Barrier Жесткость — предназначен для жесткой водопроводной воды, имеет более высокий ресурс по жесткости, соответственно, способен дольше и эффективнее предупреждать образование накипи;
• Железо — картридж для Барьера, который помимо основных примесей способен удалять железо из водопроводной воды с характерной проблемой, убирает металлический запах воды и рыжие налет на чайнике.

Если вы приобрели фильтр барьер, картридж стоит также купить сразу, так как рекомендуется менять его после пропускания 320 литров воды. Для вашего удобства можно сразу приобрести комплекты из двух, трех и четырех картриджей.

Как заменить картридж?

Чтобы вовремя произвести обслуживание фильтра нужно для начала купить картридж Барьер, который подойдет вашей воде.

Чтобы сменить кассету фильтра, необходимо выполнить ряд операций:

1. выкрутить старый картридж из пазов и утилизировать его;
2. помыть все детали фильтра со средством для мытья посуды под проточной водой, или в посудомоечной посуде;
3. замочить картридж в водопроводной воде на 5-10 минут и потрясти его для удаления воздуха;
4. вкрутить новый элемент в пазы и спустить две первых порции воды;
5. установить на механическом индикаторе, если присутствует, дату замены.

Картридж «Кассета Ультра» — Обзор на сайте Росконтроль.рф

Кассета фильтрующая сменная «Барьер Ультра» производится фирмой «Барьер». Заявленный ресурс кассеты — 200 л воды. 

Важным показателем является скорость фильтрации и ресурса. Для расчета этого индекса эксперты проверили отрезок времени, в течение которого катридж фильтрует 1 л воды. Оказалось, что новый картридж, при всех прочих достоинствах, фильтрует воду довольно медленно: 1 л воды за 12 мин 26 с, а картридж с истекающим ресурсом — за 15 мин 17 с.

Экспертиза проходила в 3 этапа. Через новые фильтры и фильтры с истекающим ресурсом пропускали обычную водопроводную воду и воду, специально загрязненную на уровне 2 ПДК. После этого сравнивали минеральный состав и степень загрязнения исходной и профильтрованной воды и делали вывод об эффективности. Вода, используемая в тестировании, — т.н. исходная вода, — в документах по результатах экспертизы обозначена как «Проба №5». 

Новый картридж эффективно устраняет запах и цветность фильтруемой воды. Важно, что при этом вода не получает постороннего запаха или привкуса. Данный картридж не увеличивает мутность фильтруемой воды (это бывает, когда из картриджа вымывается фильтрующая загрузка), но и не уменьшает (при том минимальном уровне мутности, который характерен для воды из московского водопровода). 

Новый картридж уменьшает показатели загрязнения воды органическими веществами и эффективно уменьшает концентрацию токсичных элементов (в частности таких, как свинец и алюминий, которые в очень небольшом количестве присутствуют в воде московского водопровода, которая использовалась для тестирования фильтров). Картридж эффективно снижают концентрацию остаточного хлора и галогенсодержащих органических соединений (при содержании остаточного хлора на уровне ПДК). Здесь фильтрующая кассета «Барьер» оказалась наиболее эффективной по сравнению с другими моделями картриджей.

Следует отметить, что картридж достоверно не меняет содержание железа в фильтруемой воде (при том небольшом уровне железа, который содержится в воде московского водопровода). Кроме того, картридж не изменяет исходное содержание фторид-ионов в воде. Однако после фильтрации воды через картридж отмечены изменения показателей солевого состава и снижение физиологической полноценности минерального состава — хотя и в меньшей степени, чем у других моделей катриджей). Помимо этого, у воды, пропущенной через картридж «Барьер Ультра» незначительно изменился уровень pH (в пределах, допустимых для питьевой воды). 

Московская водопроводная вода не слишком жесткая, в ней не очень много кальция (хотя и в пределах норм физиологической полноценности), и фильтрация через данный картридж приводит к еще большему уменьшению содержания этого элемента, так как жесткость и содержание кальция уже не соответствуют нормам физиологической полноценности. Содержание магния уменьшается в меньшей степени – в профильтрованной воде его довольно много (в пределах норм физиологической полноценности). Фтора в московской воде мало (меньше, чем требуют нормы физиологической полноценности), поэтому важно, что фильтрация этой воды через картридж не привела к уменьшению содержания в ней фтора. 

Испытания с водой, специально загрязненной микробами (культурой кишечной палочки), показали, что кассета «Барьер» обеспечивает 100 % очистку воды от бактерий — возбудителей кишечных инфекций даже при их содержании в фильтруемой воде на уровне в пять раз больше допустимого в сточных водах. По совокупности показателей картридж продемонстрировал наибольшую эффективность по сравнению с другими моделями. 

Таким образом, информация в маркировке «Кассета обеспечивает 100% защиту от бактерий и эффективно очищает воду от органических и неорганических примесей: хлора, хлорорганических соединений и тяжелых металлов» является достоверной.

Смотреть Отчет НИИ ЭЧиГОС им. А. Н. Сысина

Набор сменных кассет на фильтр-кувшин для воды «Барьер» СТАНДАРТ — 4 (3шт)

Сменная кассета на фильтр для воды «Барьер» СТАНДАРТ [4] (набор из 3шт)

ОРИГИНАЛ!

Все упаковки с системой проверки подлинности!

Предназначена для использования в любых фильрах-кувшинах «Барьер».

Для водопроводной воды.

Обеспечивает высококачественную доочистку водопроводной воды от хлора, хлорорганики, тяжелых металлов, пестицидов, ПАВ и нефтепродуктов. Устраняет неприятные запахи и привкусы.

Состав: ионообменная смола, кокосовый активированный уголь, кокосовый активированный уголь,о бработанный серебром.

Кассета имеет герметичную резьбу, которая не позволяет нефильтрованной воде попасть в кувшин.

Использован высококачественный пищевой пластик, допущенный для контакта с питьевой водой.

Температура очищаемой воды не должна превышать 40°С.

Производительность кассеты «Барьер стандарт»

Эффективность очистки: хлор свободный и активный — 100%; фенол, бензол — 100%; линдан — 95-99%; ДДТ — 97-99%

Скорость фильтрации: 250-300 мл/мин

Ресурс сменной кассеты: 350 литров*

При потреблении до трех литров воды на человека в день средняя продолжительность работы одной сменной кассеты:

• для 1 человека – 90 дней
• для семьи из 2-х человек – 60 дней
• для семьи из 3-х человек – 40 дней
• для семьи из 4-х человек – 30 дней

*Ресурс сменной кассеты зависит от качества исходной воды.

• в связи с нестабильным качеством водопроводной воды БАРЬЕР рекомендует менять кассету каждый месяц.
• срок службы кассеты с начала использования – не более 3-х месяцев, независимо от объема очищенной воды.

Эксплуатация

Перед началом использования:

• промойте все детали фильтра слабым мыльным раствором, ополосните водой и вытрите насухо
• вверните сменную кассету в воронку до упора
• обязательно слейте первые 2 порции очищенной воды. В первых двух порциях возможно появление небольшого количества угольной пыли
• наливая очищенную воду из фильтра, придерживайте рычаг воронки пальцем.

Рекомендации:

• не используйте фильтр для очистки воды, небезопасной в микробиологическом отношении
• применяйте фильтр только по назначению
• необходимо не реже одного раза в месяц промывать все детали фильтра слабым мыльным раствором, ополосните водой и вытрите насухо
• не допускайте длительного нахождения фильтра под прямыми солнечными лучами
• в случае длительных перерывов в работе фильтра (более 3-х дней) отфильтрованную воду необходимо слить, а детали фильтра протереть насухо чистым полотенцем
• прежде чем снова использовать фильтр, повторите процедуру подготовки фильтра к работе

Производитель: ЗАО «МЕТТЭМ-Технологии», Россия, Московская обл. г.Балашиха

назначение и польза — Стройка Волка

Содержание статьи:

Какое самое сокровенное желание у каждого из нас? Конечно, это здоровье членов нашей семьи и их благополучие. Однако в условиях нынешней экологической ситуации любого поджидают скрытые опасности: выхлопные газы, нерациональное и повсеместное использование пластика и полиэтилена, синтетические усилители вкуса продуктов питания, перманентно накапливающийся стресс. Мы подскажем, как без усилий вы сможете победить еще один разрушающий фактор — потребление хлорированной и жесткой воды.

Зачем фильтровать воду?

Вам будет интересно:Пароварка «Тефаль»: инструкция по применению

Вода из-под крана потенциально опасна, если пить ее в чистом виде. Она содержит увеличенное количество хлора, который добавляется для обеззараживания, высокую концентрацию ионов кальция и магния (такую воду называют жесткой) и даже болезнетворные бактерии.

Конечно, можно воспользоваться старым дедовским методом и просто кипятить воду. Как оказалось, этот способ действительно помогает убить некоторые вредные микроорганизмы, но, например, споры некоторых грибов и возбудители ботулизма спокойно переживают этот процесс. Также кипячение не избавит вас от наличия хлора, а тяжелые элементы, присущие жесткой воде, и вовсе образуют сложные химические соединения, которые способны нанести реальный вред организму в виде камней в почках, отравления и нарушения обмена веществ. Поэтому оптимальный вариант обеспечить себя максимально безопасной и вкусной водой — это использовать бытовые фильтры.

Почему именно «Барьер»?

В условиях ускоренного ритма жизни и постоянного режима дедлайна и цейтнота задумываться еще и о том, чтобы качественная и полезная вода всегда была в наличии — дополнительная забота. Бутилированная — может оказаться подделкой, а проверять ее на соответствие бактериологическим и химическим стандартам нет ни времени, ни возможности. Установка стационарного фильтра, который фиксируется либо непосредственно в водопроводной системе, либо просто напрямую связан с краном — еще одна статья расходов в вашем бюджете. Таким образом, мобильный фильтр кувшинного типа, состоящий из резервуара и сменной кассеты, — самый лучший вариант. Вашей обязанностью будет только отслеживание срока службы расходного материала и своевременная его замена в случае необходимости.

Что выбрать?

Производитель предлагает несколько типов кассеты «Барьер»:

Определитесь, какая функция для вас является приоритетной, хотя минимальный и основной набор выполняет каждая из них — от кассеты «Барьер Стандарт» до «Ультра». Тем более, вы вполне можете по истечению срока службы одного вида картриджа приобрести расходный материал другого типа и, таким образом, выбрать для себя наиболее подходящий.

Зачем проверять кассеты «Барьер» на подлинность?

На официальном сайте производителя у вас есть возможность проверить очистительный элемент на оригинальность. Для этого необходимо указать дату изготовления, № упаковки и код подлинности — все эти данные указаны на коробке картриджа.

Подделка опасна тем, что может нанести прямой вред вашему здоровью. Использование некачественной продукции приведет к тому, что вы будете употреблять неочищенную воду с содержанием всех тяжелых примесей. Но может возникнуть и так, что несертифицированная кассета будет содержать в своем составе угрожающие организму элементы. Поэтому всегда приобретайте кассеты «Барьер» в проверенных точках реализации. В случае обнаружения подделки сообщите об этом по телефону, указанном на официальном сайте в разделе проверки подлинности.

Как часто менять? Условия эксплуатации и утилизации сменной кассеты «Барьер»

Фильтры более новых моделей оснащены специальным электронным индикатором, который напомнит вам о необходимости замены картриджа, чей срок службы зависит напрямую от степени выработанности ресурса.

Но производитель также позаботился и о более экономичных моделях. Вы можете зарегистрироваться на официальном сайте и в специальной форме указать дату установки кассеты для фильтра «Барьер» и ее тип, а за три дня до завершения рассчитанного срока эксплуатации вам поступит соответствующее напоминание.

Своевременная замена картриджа является важным условием для того чтобы вы и члены вашей семьи получили качественную и очищенную воду.

Кассеты «Барьер» изготовлены из безопасного и сертифицированного материала и не требуют специальных условий утилизации — достаточно стандартной процедуры, применимой к твердым бытовым отходам.

Источник

MoniSafe 500S

MoniSafe 500S

Электронный кассир с функцией рециркуляции

Электронный  кассир  MoniSafe 500S обеспечивает повышенную производительность и безопасность операционно-кассового обслуживания. Упрощение  и  ускорение операций кассира  означает,  что  кассир  сможет  больше  времени уделять общению с клиентом, а отсутствие физических барьеров между кассиром клиентом сделает это общение для клиента более приятным и располагающим.

Оптимальное решение – передовая технология обработки наличности, разработанная Nautilus Hyosung, помогает финансовым учреждениям снизить затраты на обработку наличных и повысить скорость обслуживания клиентов.

Эффективность и удобство – MoniSafe 500S устанавливается на рабочем месте операциониста — кассира и представляет собой устройство для приема, хранения и выдачи наличных денег.  Кассир может видеть степень заполнения устройства на 7” экране в режиме реального времени, а индикаторы подсказки помогают совершать денежные операции двум операционистам одновременно. MoniSafe 500S  оснащен автоматизированной системой восстановления устройства после замятия и застревания бумаги, отображения ошибки на экране дисплея и указания места замятия при помощи светодиодных указателей.

Гибкость – Электронные кассиры серии MoniSafe 500S идеально подходит для работы в отделениях с любой функциональной направленностью. Все ресайклинг кассеты могут работать независимо друг от друга, настраиваются на прием и выдачу, что несомненно повышает эффективность работы отделения и создает идеальное соотношение показателя ЦЕНА/КАЧЕСТВО.

Максимальная защита – электронный кассир серии MoniSafe 500S обладает всеми необходимыми видами защиты в соответствии с мировыми требованиями. MS 500S предлагает расширенную проверку подлинности банкнот и авто-аудит.

Программное обеспечение – для эксплуатации TCR MS500S применяется Прикладное Программное Обеспечение Российской разработки – DeltaBranchCash, обеспечивающее централизованное управление сетью TCR установленных в кредитном учреждении. 

Новый фильтр перестал пропускать воду? Не торопитесь его выбрасывать! Вот 4 простых способа все исправить | Фильтры БАРЬЕР

Бывает, что фильтр для кувшина перестает пропускать воду, даже если он совсем новый. Первая мысль: «Попалась бракованная кассета». Но есть минимум четыре причины, почему вода льется из кувшина слишком медленно. И все их легко устранить самостоятельно, не тратясь на покупку новой кассеты. Рассказываем, как вернуть фильтр-кувшин к жизни.

Причина №1: кассету неправильно транспортировали

В чем суть. Иногда в кассете скапливается воздух — например, если она растряслась во время перевозки по неровной дороге. Пузырьки воздуха мешают воде проникнуть внутрь фильтра. В итоге вода стекает в кувшин по капле или вообще не проходит через кассету.

Что делать. Вытащите кассету из фильтра, встряхните несколько раз вверх-вниз, а затем замочите ее в стакане холодной воды на 10–15 минут. Так из кассеты выйдет весь лишний воздух, и ее снова можно будет использовать.

Причина №2: кассета завоздушилась в межсезонье

В чем суть. В межсезонье в водопроводной воде повышается количество пузырьков воздуха. Попадая в фильтр, они завоздушивают кассету, из-за чего вода медленно фильтруется или вообще перестает течь.

Что делать. Выкрутите кассету из воронки и пару раз встряхните. Затем наберите в кувшин воду и слейте ее, не используя. Если это не помогло, положите кассету на ночь в сухое место при комнатной температуре.

Перед использованием новой кассеты ее нужно промыть — для этого слейте первые две порции очищенной воды из кувшина

Перед использованием новой кассеты ее нужно промыть — для этого слейте первые две порции очищенной воды из кувшина

Причина №3: примеси воды забили фильтр

В чем суть. Бывает, что после ремонта трубопровода или отключения водоснабжения вода становится мутной. Это значит, что в ней содержится слишком много примесей. Загрязнения оседают на сетке кассеты и забивают фильтр, в результате вода проходит плохо.

Что делать. Если дома часто отключают воду, лучше установить проточный фильтр грубой очистки на входе труб в квартиру. Так вы сможете удалить самые крупные частицы до того, как вода дойдет до крана. Такие фильтры грубой очистки называются магистральными.

Магистральные фильтры грубой очистки БАРЬЕР продлят жизнь сменной кассете, а еще смягчат воду во всей квартире и защитят от налета сантехнику и стиральную машину

Магистральные фильтры грубой очистки БАРЬЕР продлят жизнь сменной кассете, а еще смягчат воду во всей квартире и защитят от налета сантехнику и стиральную машину

Причина №4: пора менять кассету

В чем суть. Если кассета уже не новая, возможно, у нее просто закончился ресурс. В среднем кассета для кувшина живет 2 месяца — этого хватает на очистку 200–300 литров воды. Если ее не менять, вода в кувшине ничем не будет отличаться от водопроводной: в ней могут появиться ржавчина, хлор и даже тяжелые металлы.

Что делать. Замените кассету. У некоторых фильтров-кувшинов есть встроенный индикатор на крышке — он подскажет, когда менять кассету. Например, такая функция есть у кувшинов БАРЬЕР «Смарт ОптиЛайт».

На кувшинах «ОптиЛайт» есть электронный индикатор замены кассеты. Если он светится зеленым — все в порядке, желтым — нужно купить новую кассету через неделю, красным — ресурс исчерпан

На кувшинах «ОптиЛайт» есть электронный индикатор замены кассеты. Если он светится зеленым — все в порядке, желтым — нужно купить новую кассету через неделю, красным — ресурс исчерпан

В мобильном приложении БАРЬЕР можно отследить, когда закончится ресурс у сменной кассеты. Достаточно заполнить форму: указать, когда установлен фильтрующий элемент, сколько человек в семье и есть ли дома проблемы с накипью. Приложение рассчитает срок до замены кассеты и напомнит об окончании ресурса. Также в приложении можно заказать новую кассету.

Где купить качественную кассету для фильтра

Фильтр будет забиваться гораздо чаще, если вместо подлинной кассеты от производителя вам попалась подделка. У каждой кассеты БАРЬЕР есть уникальный 9-значный код — можно ввести его на сайте компании и проверить на подлинность.

Введите дату изготовления кассеты, серийный номер и 9-значный код подлинности — БАРЬЕР проверит, есть ли такой товар в базе данныхЕсли кассета подлинная, вы увидите это окно

Введите дату изготовления кассеты, серийный номер и 9-значный код подлинности — БАРЬЕР проверит, есть ли такой товар в базе данных

Заказать фильтр-кувшины БАРЬЕР и комплект кассет к нему можно онлайн прямо на сайте или через приложение. Так вы будете уверены, что купили оригинальный качественный фильтр, который прослужит долго.

Домашний фильтр — отличный способ избавиться от накипи в чайнике и получить чистую воду, насыщенную полезными минералами.

А вы пользуетесь дома фильтрами для воды?

АТФ-связывающих кассетных транспортеров ограничивают доставку лекарств и их эффективность против опухолей головного мозга даже при нарушении целостности гематоэнцефалического барьера

https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2020.100184Получить права и контент

Основные моменты

Кровь — целостность мозгового барьера в моделях опухоли головного мозга варьируется от интактной до отсутствующей

Сосуды опухоли головного мозга экспрессируют переносчики оттока лекарств

Транспортеры лекарств могут препятствовать проникновению лекарств и их эффективности даже в протекающих опухолях

Низкоаффинный переносчик ABC Лекарства являются предпочтительными кандидатами для лечения опухолей головного мозга

Резюме

Влияние нарушения гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) на медикаментозное лечение внутричерепных опухолей остается спорным.Мы характеризуем целостность ГЭБ в нескольких моделях внутричерепных опухолей с помощью магнитно-резонансной томографии, флуоресцентных красителей и авторадиографии и определяем распределение и эффективность доцетаксела в опухолях головного мозга, трансплантированных у Abcb1-опытных и Abcb1-дефицитных мышей. Негерметичность сосудистой сети опухоли варьирует от обширной до отсутствующей. Независимо от степени неплотности кровеносные сосуды опухоли экспрессируют переносчики АТФ-связывающих кассет (Abcb1 и Abcg2). Негерметичная сосудистая сеть приводит к более высоким уровням доцетаксела в опухоли по сравнению с нормальным мозгом.Тем не менее, Abcb1 может снижать распределение и эффективность лекарств даже в неплотных моделях. Таким образом, неплотность ГЭБ не гарантирует беспрепятственный доступ АТФ-связывающих кассетных переносчиков субстратных препаратов. Могут наблюдаться терапевтические реакции, но полный потенциал таких терапевтических средств может быть ослаблен. Следовательно, для лечения внутричерепных опухолей предпочтительны препараты, проникающие через ГЭБ, с небольшим сродством к транспортерам оттока или без него.

Ключевые слова

глиома

гематоэнцефалический барьер

таксаны

Р-гликопротеин

белок устойчивости к раку груди

опухоль головного мозга

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

© 2020 Автор (ы).

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Fujifilm и IBM установили мировой рекорд с магнитными лентами емкостью 580 ТБ

(Фото: Fujifilm)

По данным IBM, к 2025 году мир будет создавать 175 зеттабайт данных. Это 175 триллионов гигабайт, и нам нужен экономичный способ их хранения. Решение? Новый прототип магнитной ленты, побивший мировой рекорд плотности записи.

Марк Ланц, менеджер по передовым ленточным технологиям в IBM Research, объясняет, как исследователи из IBM и Fujifilm объединили более 15 лет работы, чтобы установить новый мировой рекорд в области ленточных хранилищ.Они достигли плотности записи 317 Гбит / с (гигабит на квадратный дюйм), что соответствует одной ленте, способной хранить 580 терабайт данных.

Фотография: Fujifilm
(Fujifilm)

Чтобы достичь такой высокой плотности записи, исследовательской группе пришлось разработать совершенно новую ленту и при этом создать феррит стронция (SrFe). Существующие магнитные ленты основаны на феррите бария (BaFe), но SrFe предлагает потенциал для хранения более высокой плотности при том же количестве ленты.Наряду с этим, команда также «разработала семейство новых сервомеханических технологий, включая новый шаблон сервомеханизма, который предварительно записывается в сервоприводы, прототип головки привода и набор сервоконтроллеров». Конечным результатом является лента очень большой емкости, которую можно читать при движении со скоростью 15 км / ч (9,3 мили в час).

Несмотря на то, что магнитная лента — это очень старая технология, впервые она была представлена ​​в 1952 году, но она продолжает совершенствоваться и остается чрезвычайно дешевым (копейки за гигабайт) способом резервного копирования большого количества данных.Также помогает то, что ленты остаются читаемыми в течение многих десятилетий, и дает то преимущество, что по умолчанию устанавливается физический барьер. Кража данных, хранящихся на этих лентах, означала бы фактически кражу лент и доступ к нужному оборудованию для их чтения.

рекомендовано нашими редакторами

Пока неизвестно, когда эта новая магнитная лента покинет исследовательскую лабораторию и войдет в центр обработки данных, но, вероятно, она станет предпочтительным форматом архивирования облачного хранилища, когда в конечном итоге это произойдет.

Получите наши лучшие истории!

Подпишитесь на Что нового сейчас , чтобы каждое утро получать наши главные новости на ваш почтовый ящик.

Этот информационный бюллетень может содержать рекламу, предложения или партнерские ссылки. Подписка на информационный бюллетень означает ваше согласие с нашими Условиями использования и Политикой конфиденциальности. Вы можете отказаться от подписки на информационные бюллетени в любое время.

Что такое аутентификация чипа и пина?

В Европе кредитные карты с чипом и PIN-кодом стали стандартом уже около 10 лет.

Когда я увидел устройства чтения карт, которые требовали, чтобы вы вставляли в них свою кредитную карту, прежде чем сидеть и смотреть на экран в течение, казалось, очень долгого времени, я не понял этого. Фактически, я какое-то время активно избегал этого.

Я так думал, пока не понял, в чем суть аутентификации с помощью чипа и ПИН-кода: она предназначена для обеспечения большей безопасности вашей кредитной карты и защиты от мошенничества и утечки данных.

Быстрый ответ: Аутентификация с помощью чипа и PIN-кода — это протокол безопасности, доступный через чип, встроенный в кредитную карту.Чип скремблирует данные транзакции, а также запрашивает PIN-код для авторизации транзакции.

Но, может быть, ты все еще чувствуешь то же, что и я. Вы не знаете, почему все компании, выпускающие ваши кредитные карты, присылают вам новые кредитные карты со встроенными на лицевую сторону модными маленькими компьютерными чипами.

Если вы не знаете, что такое аутентификация с помощью чипа и PIN-кода, прочтите и узнайте, почему это полезная мера безопасности, которая поможет сохранить вашу информацию в большей безопасности, чем карты без этой технологии.

Что это такое и как это работает?

Кредитные карты с аутентификацией с помощью чипа и PIN-кода выглядят почти так же, как и карты без него.

«Микросхема» в слове «чип и PIN» относится к микропроцессорной компьютерной микросхеме, встроенной в карту.

Опять же, это функция безопасности, предназначенная для защиты вашей информации и предотвращения мошенничества с кредитными картами. Есть несколько способов работы чипа (и PIN-кода) для достижения этой цели.

Идея аутентификации с использованием чипа и PIN-кода началась с Europay, MasterCard и VISA, и по этой причине кредитные карты с этой технологией также называются картами с чипом EMV. Аутентификация с помощью чипа и PIN-кода — это один из способов, которым технология защищает вас.

Микропроцессорный чип хранит ваши данные и защищает их лучше, чем карты без этой функции. Это гораздо более сложная технология, которую сложнее украсть или ею сложнее манипулировать.

«ПИН-код» в этой фразе означает четырехзначный ПИН-код, который вы можете настроить для своей кредитной карты и который потребуется, когда вы собираетесь совершить покупку. Это работает так же, как PIN-код вашей дебетовой карты.

Другие карты EMV имеют чип, но не требуют PIN-кода. Их часто называют картами с чипом и подписью, и они больше похожи на традиционные кредитные карты с магнитной полосой.

Зачем отказываться от полосы ради чипа?

До того, как карты EMV стали стандартным выпуском для держателей кредитных карт, мы использовали карты, хранящие данные на магнитной полосе.

Это сплошная полоса на обратной стороне карты. Это то, что вы использовали для чтения карт, чтобы совершить покупку.

Если вы, как и я, думали, что просто провести карту было проще, чем вставить ее в один из считывающих устройств с чипом и PIN-кодом, вы можете быть удивлены, узнав, что магнитная полоса использует ту же технологию, что и кассетные плееры, для записи информации.

Не совсем тот стандарт безопасности, который мне нужен, когда дело касается моей кредитной карты. Вот почему вы видите больше карт с чипами, хотя их производство дороже, чем старые и менее безопасные карты без них.

На этих магнитных полосах просто хранится информация о вашей карте и кредитной линии, которую кардридер может прочитать. Информация была статичной, что позволяло легко копировать и воровать с помощью таких устройств, как скиммеры.

Скиммеры для кредитных карт легко найти и дешево купить.Барьер для совершения мошенничества с кредитными картами, к сожалению, довольно низкий с этими устройствами.

Как карты EMV защищают вас и вашу информацию

Введите чип в кредитную карту, чтобы решить эту проблему. Чтобы понять, почему вы видите, что все больше компаний, выпускающих кредитные карты, переходят на аутентификацию с помощью чипа и PIN-кода в целях безопасности, вам необходимо знать, как работают сами чипы.

В то время как информация на магнитной полосе является статической, информация, хранящаяся на микросхеме микропроцессора, является динамической.Это означает, что он постоянно меняется и может передавать данные, а не просто хранить их.

Раньше считыватели карт просто считывали информацию о вашей кредитной карте через магнитную полосу. Но с чип-картами считыватель взаимодействует с картой через чип.

Чип выдает номер транзакции каждый раз, когда вы вставляете карту в автомат для оплаты.

Если карта не генерирует уникальный идентификатор транзакции, оплата не будет работать — это означает, что воры и люди, совершающие мошенничество, не могут создать и использовать поддельную карту, просто используя информацию из вашей настоящей.

Сегодня большинство кредитных карт в США имеют встроенные чипы EMV, особенно туристические кредитные карты, которые, вероятно, будут использоваться на международном уровне.

Как усложнить мошенничество с кредитными картами

Ворам нужно нечто большее, чем скиммер, чтобы получить вашу информацию.

Для кражи данных с карты с чипом и PIN-кодом требуется больше опыта, умение взламывать сложные системы и оборудование, которое намного сложнее, чем другие устройства, используемые для кражи информации кредитной карты с магнитной полосы.

То, как чип генерирует уникальный код для каждой транзакции, также означает, что ваша информация будет в безопасности на случай, если магазин, в котором вы совершали покупки, подвергнется взлому.

Эти коды нельзя использовать снова, поэтому они бесполезны для воров, которые пытаются украсть данные на основе прошлых транзакций магазина.

Кроме того, сложно создать поддельные копии карт, требующих аутентификации с помощью чипа и PIN-кода. (Это было намного проще сделать, когда на карточках была только магнитная полоса.)

Фактически, практически невозможно сделать точную копию чипа вашей кредитной карты.

Эти меры не означают, что вы никогда не станете жертвой мошенничества, если ваша карта будет украдена или кто-то получит вашу личную информацию через какой-либо канал. Но аутентификация с помощью чипа и ПИН-кода делает гораздо больше, чем кредитные карты в прошлом, для защиты потребителей.

Не забывайте о PIN-коде

Чип делает тяжелую работу по предотвращению утечки и кражи данных с помощью таких устройств, как скиммеры кредитных карт. Но PIN-код тоже играет важную роль.

«ПИН-код» в чипе и ПИН-коде — дополнительная мера безопасности.Чип лучше защищает информацию, хранящуюся на вашей карте. Но это мало что мешает кому-либо использовать вашу карту, если они ее у вас заберут.

Помните, что PIN-код работает как дебетовая карта. Его необходимо ввести, когда вы собираетесь совершить покупку. Это помогает предотвратить кражу вашей физической карты и ее использование для получения мошеннических платежей.

Если у них нет ПИН-кода, они, вероятно, не смогут использовать карту, даже если она у них на руках. Если у вас есть такая возможность, убедитесь, что вы выбрали карты с чипом и PIN-кодом, а не карты с чипом и подписью.PIN-код — это то, что останавливает людей, которые могут взять вашу карту и использовать ее без вашего разрешения.

Chip-and-PIN обеспечивает дополнительную защиту для вас и вашего кредита

Я все еще хочу подойти к кассовому аппарату и провести картой по кардридеру, хотя все больше и больше магазинов требуют, чтобы вы вставляли карту.

Но, по крайней мере, сейчас меня не так раздражает, когда машине нужен чип, а не магнитная полоса.

Технология несовершенна, и аутентификация с помощью чипа и PIN-кода не обеспечивает гарантированного способа остановить мошенничество.И для нас в Штатах самая большая проблема заключается в том, что процесс ввода чипа и PIN-кода все еще не является стандартом.

Несмотря на то, что он доступен, большинство компаний, выпускающих кредитные карты, перешли на карты с чипом и подписью, а не с чипом и PIN-кодом. Это те, которые оснащены одним и тем же микропроцессором, поэтому ваши данные в такой же безопасности.

Но вы теряете дополнительную защиту, требующую только PIN-код, который вы знаете, для авторизации платежей. Тем не менее, аутентификация с использованием чипа и PIN-кода (и даже чипа и подписи) представляет собой шаг вперед в обеспечении безопасности кредитных карт.

Вставить карту вместо того, чтобы провести ее, чтобы машина могла прочитать чип, — это крошечное изменение в моем способе совершения покупок. Взамен я получаю гораздо большую безопасность для моей кредитной карты. Стоит использовать эту новую технологию, которая лучше защищает нашу информацию.

границ | Регулирование человеческих γδ Т-клеток с помощью стабильности белка BTN3A1 и АТФ-связывающих кассетных транспортеров

Введение

Gammadelta (γδ) Т-клетки представляют собой линию врожденных «нетрадиционных» Т-лимфоцитов с сильными цитотоксическими, провоспалительными и регулирующими свойствами.Они экспрессируют в качестве определяющего признака Т-клеточный рецептор (TCR), состоящий из гетеродимеров γ- и δ-цепей, обоих продуктов рекомбинации V (D) J, что отличает их от обычных αβ Т-клеток (1).

Несмотря на то, что они часто ограничиваются различными анатомическими участками, включая кожу и эпителий кишечника, которые являются основными участками взаимодействия хозяина с микробиотой и проникновения патогенов, роль γδ Т-клеток в тканевом иммунном надзоре до конца не изучена (2, 3). Бутирофилины (BTN), по-видимому, играют ключевую роль в поддержании иммунного гомеостаза в тканевом эпителии, контролируя активацию γδ Т-клеток (4).Наблюдаемая гомология с корецепторами, такими как CD80, CD86 и PD-L1 (5), первоначально предполагала возможность лигандов для молекул BTN, экспрессируемых на поверхности Т-клеток, хотя идентификация таких рецепторов до сих пор остается неуловимой ( 6). Некоторые данные согласуются с прямым взаимодействием с γδ TCR, хотя это еще предстоит подтвердить (7–9).

Наша работа направлена ​​на понимание функции BTN в регуляции γδ Т-клеток и того, как их дисрегуляция может способствовать развитию болезни.Мы изучаем белки BTN3A человека и их роль в активации Т-клеток Vγ9 / Vδ2, известного клона γδ Т-клеток в крови и тканях человека (10). Обязательная роль парных молекул BTN3A в контроле активации Vγ9 / Vδ2 Т-клеток была недавно показана (11), и другие BTN и BTN-подобные молекулы как у мышей, так и у людей могут аналогичным образом контролировать определенные подмножества γδ Т-клеток. Например, Skint1 определяет клон дендритных эпидермальных Т-клеток Vγ5 / Vδ1 в коже мыши (12, 13), Btnl1 контролирует компартмент Т-клеток γδ энтероцитов мыши Vγ7 +, а BTNL3 и BTNL8 контролируют Vγ4 + γδ Т-клетки толстой кишки человека (4).Следовательно, эта работа, вероятно, будет иметь отношение к другим системам отбора, гомеостаза и антиген-зависимой активации γδ Т-клеток.

Известно, что линия Vγ9 / Vδ2 Т-клеток γδ активируется воздействием специфических «фосфоантигенов» (pAg), изопентенилпирофосфата (IPP) и ( E ) -4-гидрокси-3-метил-бут-2- енилпирофосфат (HMB-PP). IPP является повсеместным метаболитом во всех живых клетках и общим конечным продуктом как классического мевалонатного пути (также называемого HMG-CoA-редуктазой) у эукариот и некоторых бактерий, так и альтернативного немевалонатного пути у грамотрицательных бактерий, микобактерий, и малярийные паразиты.Микробный метаболит HMB-PP является промежуточным звеном немевалонатного пути, демонстрируя на 4log10 большую активность по сравнению с IPP (14, 15). Хотя IPP имеет более низкую биологическую активность в отношении Т-клеток Vγ9 / Vδ2 в культуре клеток и более низкое сродство к домену B30.2 BTN3A1 в анализах связывания по сравнению с HMB-PP, IPP все еще может играть физиологическую роль in vivo . Это может быть тот случай, когда внутриклеточные уровни IPP повышаются в результате нарушения регуляции мевалонатного пути, например, при обработке клеток-мишеней аминобисфосфонатными препаратами, такими как золедронат, инфекцией или клеточной трансформацией (16, 17).

Помимо продукции цитокинов и цитотоксичности, клетки Vγ9 / Vδ2 способствуют традиционной презентации пептидного антигена через MHC-I- и MHC-II-зависимые механизмы (18–20) и исследуются как потенциальные инструменты в иммунотерапии рака (21–20). 26). Кроме того, хотя γδ Т-клетки обычно связаны с воспалительными и аутоиммунными ответами (27, 28), вклад линии Vγ9 / Vδ2 в аутоиммунную патологию не изучен. В этих контекстах понимание молекулярной основы их активации посредством BTN3A-зависимой презентации pAg должно облегчить их терапевтические манипуляции (29).

При первоначальном скрининге мы идентифицировали две клеточные линии HeLa, которые заметно различались по своей способности вырабатывать цитокин из совместно культивированных γδ Т-клеток. Мы использовали эту модель, чтобы исследовать функцию молекул BTN3A в этом процессе и идентифицировать новые компоненты. Данные показывают, что воздействие окружающей среды, такое как обработка клеток цитотоксическим противораковым препаратом доксорубицином (DOX), может влиять на активацию γδ Т-клеток посредством регуляции стабильности белка BTN3A или переноса и экспрессии транспортеров АТФ-связывающей кассеты (ABC) через путь стрессового ответа KEAP1 / NRF2.

Материалы и методы

Конструкции выражений

Последовательности праймеров

перечислены в таблице S1 дополнительных материалов. ДНК, кодирующая специфические олигонуклеотиды shRNA, направленные на изоформы BTN3A, периплакин и ABCG2, клонировали в pHR-SIREN / puro с использованием Bam HI / Eco RI, как описано ранее (30). Вирусные частицы получали путем котрансфекции клеток 293T плазмидами pCMV8.91 (gag-pol) и pMDG (VSV-G env). Супернатант собирали через 48 часов, фильтровали и использовали для трансдукции клеток HeLa.Клоны отбирали пуромицином (1 мкг / мл) в течение 24 часов. Олигонуклеотидная последовательность shRNA, нацеленная на все изоформы BTN3A, была: shBTN3A.CGTGTATGCAGATGGAAAG. Для повторной экспрессии клетки HeLa shRNA ^BTN3A котрансдуцировали лентивирусом, несущим вариантные последовательности BTN3A1. Клетки, положительные по зеленому флуоресцентному белку (GFP), сортировали с использованием сортировщика клеток BD FACSAria.

Клеточные линии и конструкции ДНК

клеток карциномы шейки матки HeLa-M (подарок от Dick van den Boomen CIMR, Кембридж) и HeLa-L (от Will McEwan, MRC-LMB, Cambridge) выращивали в стандартных условиях культивирования тканей с использованием среды RPMI-1640 плюс 10% FCS. , пенициллин / стрептомицин (100 Ед / мл) и l-глутамин (2 мМ).Клетки обычно проверяли на микоплазму (MycoAlert Lonza LT07-218). HLA-типирование было выполнено лабораторией гистосовместимости и иммуногенетики (типирование тканей) больницы Адденбрука. Эмбриональные клетки почки 293T человека и клетки карциномы мочевого пузыря EJ28 также выращивали в среде с добавлением RPMI-1640. Фибробласты крайней плоти человека HFF-T и MRC-5T легких плода, оба иммортализованные экспрессией hTERT, каталитической субъединицы теломеразы человека (подарок Стивена Грэма, Департамент патологии), выращивали в среде DMEM с добавками.

Клетки

(1 × 10 ⁵ ), растущие в шестилуночных планшетах, трансфицировали конструкциями для экспрессии ДНК с использованием Fugene (Promega). Для ОТ-ПЦР общую РНК получали из культивируемых клеток с использованием RNAeasy mini (Qiagen) и Superscript III (Invitrogen), используемых для получения первой цепи кДНК. Амплификацию проводили с использованием 2 × полимеразы Taq BiomixRed (Bioline). Продукты ОТ-ПЦР анализировали гель-электрофорезом и клонировали с использованием Zero-Blunt Topo (Invitrogen).

Анализ киллинга проводили путем исключения красителя пропидий-йодид (PI) в клетках, обработанных доксорубицином DOX (Cell Signaling).Клетки собирали и окрашивали в 100 мкл PBS (2,5 мкг / мл PI) в течение 5 минут перед промывкой и анализом с помощью сортировки активированных флуоресценцией клеток (FACS) на BD FACScalibur и точек данных, собираемых на FL3 / FSC. В клеточных анализах использовали ингибиторы MG132 (5 мкМ в течение 5 часов) и бафиломицин A (bafA) (5 мкМ 10 часов). Для активации супернатанты собирали из 24-часовых совместных культур клеток Vγ9 / Vδ2 T и HeLa-M, содержащих 10 нМ HMB-PP (Echelon), и использовали при разведении 1/10 в течение 24 и 48 часов.

Иммуноблоттинг и количественная масс-спектроскопия поверхностно-биотинилированных белков

Лизаты клеток готовили в буфере (50 мМ Tris – Cl, pH 7.5, 150 мМ NaCl, 1% Triton-X, ингибитор протеазы без ЭДТА, Roche) путем инкубации в течение 10 мин при 4 ° C, затем предварительно очищали центрифугированием. Для иммунных блотов очищенные лизаты солюбилизировали в буфере SDS-PAGE (5 мин, 95 ° C) и разделяли в 10% гелях SDS-PAGE (NextGel), затем переносили на мембрану PVDF. Антитела добавляли непосредственно к заблокированным мембранам (5% Marvel / PBS 0,1% Tween 20) и инкубировали в течение 1 ч с первичными и вторичными антителами, конъюгированными с HRP. Блоты визуализировали с помощью реагента ECL (GEhealthcare) перед экспонированием на рентгеновской пленке (Fuji).Использовались моноклональные CD277 20.1 (LifeSpanBio), NRF2 (AF3925 R&D Systems), ABCG2 (ab108312), антикалнексин (3811-100) и анти-GFP (SAB4301138), а также кроличьи поликлональные сыворотки 056 и B6 против B30.2. при концентрации от 0,5 до 1 мкг / мл (30). Фракционирование клеток проводили с использованием набора для отделения клеток Qproteome (Qiagen).

Для профилирования плазматической мембраны (PMP) клетки HeLa-M (5 × 10 ⁷ ) в больших колбах T175 либо оставляли необработанными, либо обрабатывали HMB-PP (10 нМ в течение 10 часов).Клетки промывали (1 × PBS), затем добавляли реагенты для биотинилирования (30 мин при 4 ° C). После гашения клетки собирали соскабливанием и обрабатывали для иммунопреципитации, лизисом в 1% буфере Tx-100 TBS pH 8 с ингибитором протеаз (без полного EDTA, Roche) и вращением от конца к концу в течение 30 мин при 4 ° C. После центрифугирования (10000 г в течение 10 минут) к супернатантам добавляли стрептавидиновую агарозную смолу (Thermo Fisher) с инкубацией в течение 2 часов при 4 ° C. Гранулы агарозы промывали (20 ×) в буфере для лизиса, 20 × в 0.5% SDS в PBS, 20 × в 6 М мочевине / бикарбонате триэтиламмония (TEAB), pH 8,5, 5 × в TEAB, pH 8,5 перед расщеплением в течение ночи с 0,5 мкг трипсина в конечном объеме 50 мкл TEAB (31). Полученные пептиды анализировали методом ЖХ-МС / МС с использованием прибора Orbitrap Fusion (Thermo Fisher) с 60-минутным градиентом. Необработанные данные были проанализированы с использованием MASCOT из Proteome Discoverer (Thermo Fisher) v2.0 против референсного протеома человека Uniprot. Идентификацию пептидов контролировали при 1% FDR с использованием Mascot Percolator.Белки количественно определяли без использования меток с использованием узла количественного определения иона-предшественника.

Анализ Т-клеток

Этическое разрешение на работу с образцами крови от здоровых доноров было получено от местного этического комитета Юго-Восточного Уэльса (08 / WSE04 / 17) и Кембриджского местного этического комитета (HBREC.2015.27). Все добровольцы дали письменное информированное согласие.

Т-клеток Vγ9 / Vδ2 были размножены из мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров с 1 мкМ золедроната (Zometa; Novartis) и 50 ед / мл IL-2 (Proleukin, Chiron) в течение 14 дней и дополнительно обогащены до чистоты> 98% CD3 + Vγ9 + путем отрицательной селекции с использованием модифицированного набора для выделения человеческих γδ Т-клеток, который истощает В-клетки, αβ Т-клетки, NK-клетки, дендритные клетки, стволовые клетки, гранулоциты и моноциты (Stem Cell Technologies).Если не указано иное, клетки-мишени HeLa предварительно обрабатывали 10 мкМ золедроната или 10 нМ HMB-PP, затем тщательно промывали перед сокультивированием с γδ Т-клетками в соотношении 1:10 (10 ⁴ мишень: 10 ⁵ Т-эффекторных клеток ). Количество IFN-γ, секретируемого в супернатант культуры в течение 24 часов, измеряли с помощью ELISA (eBioscience). Мобилизацию CD107a на клеточную поверхность в течение первых 5 часов совместного культивирования определяли с использованием PE-конъюгированного антитела против CD107a (h5A3; BD Biosciences) в присутствии монензина в разведении 1: 2000 (GolgiStop).Клетки получали на FACS Canto II и анализировали с помощью FlowJo. Клетки HeLa также инкубировали с агонистическим моноклональным антителом CD277 20.1 (eBioscence) для индукции активации независимо от фосфоантигена.

Мышиная Т-клеточная гибридома 53 / 4r / mCD28 TCR MOP была использована для тестирования активации Vγ9 / Vδ2 TCR, как описано (32). В этих экспериментах клетки HeLa, используемые в качестве стимуляторов (10 ⁴ ), высевали в 96-луночный планшет для культивирования ткани с плоским дном, давая им прилипнуть в течение 1 дня перед добавлением Т-клеток в свежую культуральную среду.Продукцию мышиного IL-2 в супернатантах культур тестировали с помощью коммерческого набора для ELISA мышиного IL-2.

Результаты

Две гаплоидентичные линии клеток HeLa, HeLa-L и HeLa-M, демонстрируют заметные вариации в их способности активировать Vγ9 / Vδ2 Т-клетки

через BTN3A

Различные линии опухолевых и первичных эпителиальных клеток были протестированы на их способность реагировать на золедронат аминобисфосфонатного лекарственного средства и представлять микробное соединение HMB-PP на Т-клетки Vγ9 / Vδ2 (рисунок S1A в дополнительном материале).Две клеточные линии карциномы эпителия шейки матки HeLa, HeLa-L и HeLa-M, показали глубокие различия в их способности индуцировать цитокины (рисунок 1; рисунок S1 в дополнительных материалах). Клетки HeLa-M были гораздо более эффективными, чем клетки HeLa-L, в стимуляции высвобождения IFN-γ (Рисунок 1A; Рисунок S1B в дополнительном материале) и TNF-α (Рисунок S1C в дополнительном материале) после предварительной обработки HMB-PP. Ответы на золедронат аналогичным образом различались между двумя линиями клеток (данные не показаны). Ответы на любую клеточную линию HeLa отменялись экспрессией одной shRNA, нацеленной на три изоформы BTN3A (shRNA ^{, BTN3A} клетки), что подтверждает важность BTN3A в опосредовании ответов Т-клеток Vγ9 / Vδ2 как на HMB-PP, так и на золедронат (Фигуры 1A). , Б).

Рисунок 1 . HLA-гаплоидентичные клетки HeLa-L и HeLa-M различаются по своей способности представлять фосфоантигены Т-клеткам Vγ9Vδ2. (A) Активация Vγ9 / Vδ2 Т-клеток, обнаруженная по продукции IFN-γ. Клетки дикого типа и shRNA ^BTN3A HeLa-L и HeLa-M клетки предварительно обрабатывали гидрокси-3-метил-бут-2-енилпирофосфатом (HMB-PP) (10 нМ в течение 5 часов) перед добавлением расширенного Vγ9 / Vδ2. Т-клетки при соотношении Е: Т 10: 1. После инкубации в течение ночи супернатанты культур анализировали с помощью ELISA.Гистограмма показывает среднее значение и стандартное отклонение от трех измерений с использованием Т-клеток от одного донора и представляет три независимых эксперимента с использованием Т-клеток от разных доноров. (B) Нокдаун экспрессии BTN3A путем экспрессии shRNA в клетках HeLa. Транскрипты для BTN3A и β-актина амплифицировали с помощью RT-PCR из матрицы кДНК BTN3A и shRNA ^BTN3A HeLa-L и HeLa-M HeLa-L дикого типа и продуктов и анализировали с помощью гель-электрофореза. Показанные результаты ПЦР являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. (C) Активация Vγ9 / Vδ2 Т-клеток, обнаруженная с помощью ELISA для IFN-γ, как в (A) , с использованием градиента концентрации HMB-PP, агонистического антитела CD277 20.1 и Т-клеток, размноженных от двух отдельных доноров. Активацию индуцировали предварительной обработкой клеток HeLa с использованием HMB-PP в течение 5 часов (левая панель) и моноклонального антитела против BTN3A 20.1 в течение 30 минут (правая панель). Графики показывают среднее значение и стандартное отклонение от n = 2 и представляют два независимых измерения. (D) Активация Т-клеток Vγ9 / Vδ2, обнаруженная с помощью проточной цитометрии для процента дважды положительных клеток Vγ9 и CD107a после экспериментов по совместному культивированию, как в (C) .

Дифференциальная реактивность Т-клеток Vγ9 / Vδ2 на клетки HeLa-L и HeLa-M была воспроизведена при использовании пан-BTN3A-специфического агонистического антитела CD277 20.1, которое индуцирует BTN3A-зависимую активацию активации Т-клеток Vγ9 / Vδ2 в отсутствие HMB-PP или золедронат (рис. 1C). Кроме того, продукция IL-2 из мышиной Т-клеточной гибридомы, экспрессирующей человеческие трансгены Vγ9 / Vδ2, показала сходный дифференциальный ответ на HMB-PP (фигура S1D в дополнительном материале).

В отличие от этих результатов секреции цитокинов как функционального считывания ответов Т-клеток, поверхностная мобилизация CD107a / LAMP1 не различалась между Т-клетками Vγ9 / Vδ2, отвечающими на две линии HeLa, на HMB-PP или CD277 20 .1, предварительная обработка антителом (рис. 1D), что указывает на необходимость дифференциальной передачи сигналов для индукции секреции цитокинов по сравнению с мобилизацией CD107a.

В совокупности эти эксперименты продемонстрировали, что клетки HeLa-M были более эффективны при активации Vγ9 / Vδ2 Т-клеток через BTN3A, чем клетки HeLa-L, в отношении индукции экспрессии цитокинов, но не мобилизации CD107a. Эти клеточные линии, таким образом, представляют собой полезную экспериментальную модель для исследования молекулярного механизма, лежащего в основе специфических ответов Т-клеток Vγ9 / Vδ2 на эндогенный и экзогенный pAg.

Транскрипты BTN3A идентичны в HeLa-L и HeLa-M

Чтобы учесть функциональные различия между клетками HeLa-L и HeLa-M, полноразмерные транскрипты BTN3A амплифицировали с помощью RT-PCR из кДНК HeLa, клонировали и секвенировали (рис. 2). Как показано на фиг. 2A, транскрипты всех трех изоформ BTN3A экспрессировались на сопоставимых уровнях как в HeLa-L, так и в HeLa-M, без различий в сплайсинге, и все они были нацелены с одинаковой эффективностью shRNA. При сравнении шести клонов из каждой клеточной линии для каждой изоформы BTN3A с консенсусными последовательностями (BTN3A1 NM_007048, BTN3A2 NM_007047, BTN3A2 NM_007047, BTN3A3 NM_006994) не было обнаружено вариаций последовательности или мутации (данные не показаны).Известные синонимичные SNP, распространенные в Африке к югу от Сахары, но редко встречающиеся в других популяциях, были идентифицированы во всех последовательностях BTN3A1 (dbSNP rs3857550, rs2393650 и rs537072716), что позволяет предположить, что обе линии HeLa были гомозиготными по этим полиморфизмам. Нуклеотидные последовательности BTN3A2 и BTN3A3 не показали полиморфизма; однако исключение аллелей или смещение гаплотипа в экспрессии транскриптов не оценивалось. Путем тканевого типирования геномной ДНК обе клеточные линии HeLa были гаплоидентичны по HLA-A68-B15: 03/15 -Bw6 -C12 -DR 01: 02/01: 2601.Эти данные обеспечили убедительную аутентификацию линий HeLa по подтверждению их общего генетического происхождения.

Рисунок 2 . Транскрипты трех изоформ BTN3A не изменены в HeLa-L и HeLa-M. (A) Амплификация полноразмерных транскриптов BTN3A1, BTN3A2 и BTN3A3 с помощью ОТ-ПЦР из дикого типа и shRNA ^BTN3A HeLa-L и матрица кДНК HeLa-M. (B) ОТ-ПЦР для BTN3A1, BTN2A1 и MHC-II (DMα) из кДНК, полученной из клеток HeLa-M, оставленных без обработки или обработанных IFN-α или IFN-γ.Продукты RT-PCR анализировали с помощью гель-электрофореза с β-актином в качестве контроля нагрузки. Результаты представляют три эксперимента. (C) Анализ маркеров активации MHC-I (w6 / 32), MHC-II (L243) и BTN3A (CD277 20.1) методом проточной цитометрии в клетках HeLa, обработанных IFN-γ или без него. Результаты репрезентативны для трех экспериментов. Красные линии обозначают образцы, обработанные IFN-γ, а черные линии — необработанные образцы. Сплошные линии — HeLa-M, пунктирные — HeLa-L. (D) Экспрессия маркеров активации, обнаруженная с помощью ОТ-ПЦР, в клетках HeLa-L и HeLa-M, оставленных необработанными или обработанными супернатантом сокультуры клеток γδ T / HeLa-M, собранным, как описано (см. «Материалы и методы»).Транскрипты BTN3A1, HLA-E, DMα, CIITA, TRIM21, CXCL10, IDO-1 и BTN2A1 амплифицировали и визуализировали с помощью гель-электрофореза. Результаты являются репрезентативными для повторяющихся экспериментов. (E) Экспрессия взаимодействующих с BTN3A1 молекул белка периплакина (PPL) и RhoB в обработанных и необработанных клетках HeLa-L и HeLa-M, проанализированных с помощью RT-PCR, как в (C) , с транскриптами для β-актина в качестве контроля загрузки. Результаты репрезентативны для повторяющихся экспериментов. (F) Лизаты из клеток HeLa-L и HeLa-M, оставленных необработанными или обработанными супернатантом сокультуры клеток γδ T / HeLa-M или IFN-γ, анализировали вестерн-блоттингом на экспрессию белка PPL.Дублирующиеся блоты зондировали антителом к ​​калнексину (CNX) в качестве контроля загрузки. (G) Фракционирование клеток для сравнения субклеточного распределения белка PPL в клетках HeLa-L и HeLa-M. Были приготовлены фракции растворимых (1), мембранных (2), ядерных (3) и цитоскелетных / устойчивых к детергентам мембран (4) и проанализированы с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против PPL, β-тубулина, CNX и β-актина. .

Не влияет на клеточные маркеры активации

Было показано, что

транскриптов BTN3A1 индуцируются интерферонами типа I и типа II, и клетки HeLa-L и HeLa-M не различались в этом отношении (фигура 2B и данные не показаны).По данным цитометрии, наблюдалась сопоставимая активация поверхностных MHC-I и MHC-II обработкой IFN-γ; однако окрашивание поверхности с использованием антитела CD277 20.1 не было обнаружено, что указывает на несоответствие между регуляцией транскрипции и экспрессией белка (рис. 2С).

Чтобы исследовать возможность растворимого фактора, влияющего на активацию Т-клеток, а также более физиологически значимого стимула, потенциально влияющего на экспрессию BTN3A1, мы изучили ответ обеих линий HeLa на обработку супернатантами, собранными из 24-часовых совместных культур Т-клеток Vγ9 / Vδ2. активируется нагруженными HMB-PP (10 нМ) клетками HeLa-M.Транскрипты для ряда маркеров активации, включая MHC-II DMα, HLA-E, трансактиватор MHC-II CIITA и TRIM21, анализировали с помощью RT-PCR в дополнение к BTN3A1 (рис. 2D). Были обнаружены некоторые вариации в транскриптах, происходящих от HeLa, особенно в CXCL10 и IDO-1, и небольшое увеличение транскриптов BTN3A1 при активации в HeLa-M не наблюдалось в HeLa-L. Однако убедительная экспрессия или активация BTN3A на поверхности клетки не была обнаружена цитометрией с использованием антитела CD277 20.1, как на фиг. 2C (данные не показаны).Транскрипты BTN2A1 не различались между образцами, и не было корреляции между экспрессией бутирофилина BTN2A или BTN3A и CIITA / MHC-II в клетках HeLa (6). Может потребоваться более подробный количественный анализ некоторых транскриптов, например CXCL10 или IDO-1, но данные до сих пор не согласовывались с основным дефектом передачи сигналов в линии HeLa, который мог бы объяснить дифференциальные ответы в анализах Т-клеток или с транскрипционным контроль, влияющий на активацию BTN3A1.

Нет изменений в выражении взаимодействий BTN3A1

Цитоскелетный адаптерный белок периплакин (PPL) и RAS-суперсемейство GTPase RhoB были недавно идентифицированы как взаимодействующие молекулы BTN3A1 (30, 33).Мы проверили, может ли дифференциальная BTN3A1-зависимая ответная реакция Т-клеток Vγ9 / Vδ2 на нагруженные HMB-PP HeLa-L и HeLa-M быть следствием вариаций в экспрессии PPL и / или RhoB. В дублированных экспериментах с ОТ-ПЦР транскриптов для PPL было немного больше в HeLa-L по сравнению с HeLa-M. Путем анализа отдельных доменов мРНК не было обнаружено никаких изменений в сплайсинге, которые предположительно могли бы повлиять на белковые взаимодействия или опосредованное shRNA супрессию транскрипта (рис. 2E). Помимо самого PPL, мы обнаружили транскрипты для взаимодействующей с PPL молекулы PLEC1 (рис. 2E), но не для казрина или энвоплакина (34–36).Транскрипты RhoB были обнаружены в большом количестве в обеих линиях HeLa, и на них явно не влияла активация супернатантами совместных культур γδ Т-клеток / HeLa-M. Методом вестерн-блоттинга не было обнаружено серьезных различий в уровне белка PPL между линиями клеток HeLa ни с активацией, ни с активацией с использованием IFN-γ, ни без нее, или с использованием супернатантов Т-клеток (рис. 2F). Мы также не увидели каких-либо расхождений в клеточном распределении по фракционированию клеток; PPL был равномерно распределен во фракциях растворимых, мембранных, ядерных и цитоскелетных / устойчивых к детергентам мембран, как показано ранее (рис. 2G) (30).

Эти эксперименты показали, что различия в экспрессии взаимодействующих молекул BTN3A1 не объясняют функциональные различия между клетками HeLa-L и HeLa-M. Напротив, при прямом сравнении в анализах Т-клеток линий нокдауна HeLa-L и HeLa-M PPL, полученных путем экспрессии трех различных кшРНК, нацеленных на PPL (рисунок S2 в дополнительном материале), наблюдается широкий разброс в ответах, измеренных с помощью IFN-γ. был обнаружен. Эксперименты по нокдауну PPL соответствовали нашему первоначальному выводу о регуляторной, а не обязательной роли PPL в передаче сигналов активации Т-клеткам (30).

Обнаружение BTN3A1 путем повторной экспрессии в shRNA

^BTN3A Клетки

Хотя транскрипты мРНК можно было обнаружить, белки BTN3A не экспрессировались в большом количестве в клетках HeLa. Кроме того, связывание антитела CD277 20.1 с клетками HeLa не было убедительным с помощью цитометрии (рис. 2C), несмотря на тот факт, что это агонистическое антитело вызывало сильную активацию Т-клеток Vγ9 / Vδ2 (рис. 1B). Чтобы преодолеть ограничения, связанные с низкими уровнями экспрессии, мы повторно экспрессировали изоформы BTN3A в клетках дикого типа и в клетках с нокдауном BTN3A (shRNA ^BTN3A ) с использованием лентивирусного вектора, который давал независимый маркер экспрессии трансгена посредством обнаружения GFP (фигуры 3А, Б).

Рисунок 3 . Обнаружение BTN3A1 путем повторной экспрессии в клетках shRNA ^BTN3A . (A) Схема белка BTN3A1 и структура двух основных стимулирующих фосфоантигенов (pAg) гидрокси-3-метил-бут-2-енилпирофосфата (HMB-PP) и изопентенилпирофосфата (IPP). Выделены участки взаимодействия pAg в домене BTN3A1 B30.2, взаимодействия белка периплакина (PPL) в прилегающем мембранном домене (JMD) и антител, используемых для обнаружения.BTN3A3 имеет структуру, аналогичную BTN3A1, тогда как BTN3A2 усечен после JMD и не имеет домена B30.2. (B) Схема лентивирусного экспрессионного вектора BTN3A pHRsinIRESgfp, используемого в исследованиях повторной экспрессии. Независимая мера экспрессии трансгена обеспечивается внутренним сайтом входа в рибосомы (IRES), управляемым зеленым флуоресцентным белком (GFP). (C) Вестерн-блоттинг клеток HeLa-L, временно трансфицированных векторами экспрессии для BTN3A1, BTN3A2 и BTN3A3. Моноклональные антитела против BTN3A (CD277 20.1) использовали антитело и поликлональные сыворотки 056 и B6, направленные к доменам B30.2 BTN3A1 и BTN3A3, соответственно. Антитела против GFP и калнексина (CNX) обеспечивали контроль нагрузки для экспрессии трансгена и эндогенных белков соответственно. (D) Вестерн-блот-анализ стабильных линий повторной экспрессии BTN3A1 клеток HeLa-L и HeLa-M shRNA ^BTN3A , необработанных или обработанных MG132 или бафиломицином A (bafA). Использовали антитело против CD277 20.1 и поликлональные сыворотки 056 вместе с контрольными антителами против GFP и CNX, как в (C) .Обнаружение полос реактивного белка CD277 20.1 и 056 потребовало длительного воздействия рентгеновской пленки.

Путем временной трансфекции HeLa-L или HeLa-M векторами экспрессии для BTN3A1, BTN3A2 и BTN3A3 не было обнаружено значительного поверхностного окрашивания антителом CD277 20.1 ни для одной из трех изоформ BTN3A, даже при высокой экспрессии трансгена GFP (Рисунок S2A. в дополнительных материалах). Напротив, BTN3A2 и BTN3A3, но не BTN3A1, продуктивно экспрессировались на поверхности клеток 293T с использованием одной и той же стратегии трансфекции, что указывает на то, что поверхностная экспрессия BTN3A / CD277 строго регулируется с помощью механизма, который преимущественно нацелен на BTN3A1 и который различается между клетками. линий.

Посредством вестерн-блоттинга лизатов временно трансфицированных клеток наблюдались заметные различия в способности антитела CD277 20.1 обнаруживать различные изоформы BTN3A (фиг. 3C; фиг. S2B в дополнительных материалах). В то время как BTN3A1 был едва обнаружен, BTN3A2 был в изобилии (на уровнях, ожидаемых от экспрессии трансгена), а BTN3A3 экспрессировался на промежуточных уровнях. Подлинная экспрессия полноразмерных белков была подтверждена в некоторых экспериментах с использованием антисывороток, специфичных для изоформ, направленных против B30.2 домена BTN3A1 и BTN3A3 (рис. 3C; рис. S2 в дополнительных материалах), требующих длительного воздействия рентгеновской пленки.

Вышеупомянутые эксперименты указали на внутриклеточную контрольную точку для экспрессии BTN3A1. Чтобы определить, опосредовано ли это деградацией белка, мы протестировали действие ингибитора протеасом MG132 и bafA, ингибитора путей лизосомы / аутофагии, на экспрессию BTN3A1 в клетках HeLa-L и HeLa-M shRNA ^BTN3A , трансдуцированных лентивирусом (рис. 3D). Вестерн-блоттингом с использованием CD277 20.1, полноразмерный растворимый BTN3A1 (57 кДа) был обнаружен в необработанной линии повторной экспрессии HeLa-M, но едва обнаруживался в лизате HeLa-L. Вместо этого в образцах HeLa-L была обнаружена полоса с более низкой молекулярной массой 38 кДа, что указывает на расщепление белка BTN3A1. В качестве альтернативы белок массой 38 кДа может представлять эндогенный BTN3A2, хотя BTN3A2 не обнаруживается в большом количестве в нетрансфицированных клеточных линиях (рисунок S3 в дополнительном материале). Уровни растворимого в детергенте полноразмерного BTN3A1 были снижены обработкой MG132, но на них не повлиял bafA.Напротив, обработка клеток HeLa-L MG132 привела к появлению полноразмерного BTN3A1 (57 кДа) во фракциях, устойчивых к детергенту из лизатов Tx-100, что свидетельствует о потенциальном перераспределении BTN3A1 в мембране за счет протеасомного ингибирования.

Взятые вместе, эти результаты согласуются с механизмом, контролирующим поверхностную экспрессию изоформ белка BTN3A, в частности BTN3A1, посредством продукции, стабильности или доставки белка.

PMP обработанных HMB-PP клеток идентифицирует ABCG2

Затем мы провели поиск различий в клеточных факторах, которые могут влиять на презентацию pAg в двух линиях клеток HeLa, с использованием поверхностного биотинилирования с последующей иммунопреципитацией и количественной масс-спектроскопией (37).Клеткам HeLa-M давали прилипнуть (10 ч), затем либо оставляли без обработки, либо обрабатывали HMB-PP (10 нМ в течение 10 ч) перед PMP, как описано (38).

С помощью этого подхода ABCG2 (также называемый белком устойчивости к раку молочной железы) был идентифицирован как кандидат, на экспрессию которого в клетках HeLa-M значительно влиял HMB-PP (рис. 4A). ABCG2 является членом суперсемейства переносчиков ABC и первоначально был охарактеризован как насос для оттока лекарств (39). Вариация выражения была умеренной (log2 = 2.69 увеличение), но было обнаружено несколько независимых пептидов ABCG2. FAM129B, молекула, участвующая в активации RAS, была еще одним кандидатом, потенциально затронутым обработкой HMB-PP (log2 = 2,15 увеличение) (40). С помощью ОТ-ПЦР из панели необработанных и обработанных кДНК HeLa (фиг. 4B) транскрипты для ABCG2 были уменьшены в HeLa-L по сравнению с образцами HeLa-M, наблюдение не наблюдалось для других кандидатов, в то время как транскрипты FAM129B не менялись (фиг. 2В, Г). Снижение экспрессии общего белка ABCG2 в HeLa-L по сравнению с лизатом клеток HeLa-M было подтверждено вестерн-блоттингом (фиг. 4C), но вариации в экспрессии при обработке HMB-PP не было, и поверхностный ABCG2 не был обнаружен с помощью проточной цитометрии.Однако было замечено снижение уровней ABCG2 при лечении MG132 (Рисунок 4C), аналогичное тому, которое было обнаружено для BTN3A1 (Рисунок 3D). Экспрессия NRF2 (связанный с ядерным фактором эритроид 2 фактор 2), основного белка лейциновой молнии (bZIP) и главного регулятора транскрипции ABCG2, была стабилизирована в образцах, обработанных MG132, как и ожидалось, с повышенными уровнями NRF2, очевидными в HeLa-M по сравнению с HeLa-M. Образцы HeLa-L, согласующиеся с более высокой экспрессией ABCG2 в этих клетках (рис. 4C).

Рисунок 4 .Профилирование плазматической мембраны (PMP) с помощью масс-спектроскопии идентифицирует ABCG2. (A) Таблица лучших совпадений, идентифицированных с помощью PMP для сравнения обработанных HMB-PP и необработанных клеток HeLa-M. Было обнаружено несколько независимых пептидов переносчика АТФ-связывающей кассеты (ABC) ABCG2 с умеренным увеличением (log ₂ 2,69) при обработке. Перечислены другие потенциальные кандидаты по этим критериям (C3orf52 и FAM129B), которые были менее значимыми. (B) Нарушение регуляции подмножества переносчиков ABC, включая ABCG2, в клетках HeLa, обнаруженных с помощью ОТ-ПЦР.КДНК матрицы получали из тотальной РНК из клеток HeLa-L и HeLa-M, оставленных необработанными или обработанных супернатантом γδ Т-клеток в течение 24 часов. Продукты ОТ-ПЦР анализировали с помощью гель-электрофореза. (C) Вариация экспрессии белка ABCG2 в клетках HeLa по данным вестерн-блоттинга. Верхняя панель: клетки HeLa-L и HeLa-M не обрабатывали или обрабатывали MG132 (5 мкМ в течение 10 часов) или HMB-PP (10 нМ в течение 10 часов). Клеточные лизаты получали и анализировали с использованием антител, направленных на ABCG2, NRF2 и калнексин (CNX), который действует как контроль загрузки.Нижняя панель: вестерн-блоттинг клеток shRNA ^ABCG2 подтверждает снижение экспрессии белка ABCG2. (D) HeLa-M клетки демонстрируют ABCG2-зависимую устойчивость к цитотоксическому лекарственному средству доксорубицину (DOX). Клетки HeLa-M, HeLa-L и shRNA дикого типа ^ABCG2 HeLa-M инкубировали (24 ч) с DOX в указанных концентрациях. Клетки окрашивали иодидом пропидия (PI) (2,5 мкг / мл в течение 5 мин) в качестве маркера целостности плазматической мембраны. После отмывки клетки анализировали цитометрией.На диаграмме показана средняя интенсивность флуоресценции (MFI) окрашивания PI. (E) Отсутствие эффекта на активацию Т-клеток с использованием shRNA ^ABCG2 клеток HeLa-M. Влияние на эффективность активации Vγ9 / Vδ2 Т-клеток для ряда линий нокдауна гена HeLa-M, включая shRNA BTN3A1, ABCG2, RhoB, PLEC1 и TRIM21. Клетки предварительно обрабатывали HMB-PP (10 нМ в течение 6 часов) перед нанесением Т-клеток Vγ9 / Vδ2 от одного донора. Совместное культивирование продолжалось в течение ночи, когда супернатанты культур анализировали с помощью ELISA.На диаграмме показано изменение в процентах (%) детектированного IFN-γ по сравнению с клетками HeLa-M дикого типа при повторных определениях для каждой клеточной линии.

Исходя из этих данных, ABCG2 был наиболее многообещающим кандидатом для объяснения дифференциальных эффектов клеточных линий HeLa в анализах Т-клеток, вовлекая эту молекулу в презентацию pAg. Поэтому были сконструированы клетки HeLa-M, экспрессирующие shРНК, нацеленную на ABCG2 (shRNA ^ABCG2 ). Снижение экспрессии ABCG2 в клетках shRNA ^ABCG2 было подтверждено вестерн-блоттингом (рис. 4C, нижняя панель), как и функциональный эффект в анализах киллинга за счет повышенной чувствительности к DOX, основной целевой субстрат ABCG2 (рис. 4D).Однако в анализах сокультивирования с Т-клетками Vγ9 / Vδ2 не было обнаружено никакого влияния на эффективность активации Т-клетками нагруженных HMB-PP клеток HeLa-M shRNA ^ABCG2 , как измерено с помощью ELISA для IFN-γ (рис. 4E). При использовании клеток shRNA ^BTN3A , действующих в качестве контроля, в этих экспериментах был обнаружен умеренный эффект клеток shRNA ^TRIM21 , но не влияние клеток shRNA ^RhoB или shRNA ^PLEC1 . RhoB был вовлечен ранее в презентацию pAg с использованием аналогичного shRNA-опосредованного нокдауна (33), поэтому отсутствие специфических эффектов в наших экспериментах может указывать на неэффективное подавление транскрипта или вариабельность между различными клеточными линиями.Механизм, с помощью которого TRIM21 может влиять на активацию γδ Т-клеток, не объяснен (41).

Экспрессия ряда функционально связанных переносчиков ABC была исследована с помощью RT-PCR в панели активированных клеток HeLa, включая ABCB1 (множественная лекарственная устойчивость 1, MDR1), ABCG1 (белый), ABCA1 (белок, регулирующий экспорт холестерина, CERP), ABCC1 ( белок множественной устойчивости 1) и ABCC5 (белок множественной устойчивости 5). В то время как экспрессия двух последних (ABCC1 и ABCC5) не изменялась, транскрипты для ABCB1, ABCG1 и ABCA1 менялись (рисунок 4B).ABCB1 показал образец экспрессии, подобный ABCG2, в то время как транскрипты ABCG1 и ABCA1 были обнаружены только в обработанных образцах HeLa-L, но не в HeLa-M.

Взятые вместе, результаты выявили нерегулируемую экспрессию подмножества переносчиков ABC, которая коррелировала с эффективностью активации γδ Т-клеток, предполагая связь между этими членами надсемейства белков ABC и pAg-зависимой активацией γδ T-клеток.

Обсуждение

Белки бутирофилина BTN3A являются критическими детерминантами презентации pAg Т-клеткам Vγ9 / Vδ2, но их точная роль и то, как они регулируются, полностью не изучены.Чтобы решить эту проблему и выявить новые эффекторы, мы изучили две линии клеток HeLa, которые показали заметные различия в их способности активировать Vγ9 / Vδ2 Т-клетки в ответ на нагрузку pAg. Эндогенные уровни всех изоформ BTN3A были низкими в клетках HeLa и не были обнаружены вестерн-блоттингом или проточной цитометрией. Посредством PMP с использованием количественной масс-спектроскопии в клетках HeLa-M, которые не были обработаны или обработаны HMB-PP, изоформы BTN3A1 и BTN3A2 были обнаружены на низких уровнях с небольшими вариациями при обработке.Последующие эксперименты с использованием PMP могут позволить исследовать эндогенные белки BTN3A, их регуляцию с помощью pAg и корреляцию с активацией Т-клеток в различных представляющих клетках (42).

Стабильность белка

BTN3A1 в устойчивом состоянии, когда повторная экспрессия трансгена BTN3A1 тщательно контролировалась GFP, была значительно снижена по сравнению с таковой для других изоформ, BTN3A2 и BTN3A3. Мы также обнаружили различия в белке BTN3A1 между двумя линиями клеток HeLa. Данные согласуются с регуляцией BTN3A1 на уровне стабильности белка.Усечение белка, предположительно являющееся результатом протеолитического расщепления с целью удаления домена B30.2, также было очевидным при использовании антител против BTN3A. Нельзя исключать возможность того, что посттрансляционная модификация, например посредством N-связанного гликозилирования, может влиять на распознавание антителом CD277 20.1 BTN3A1, влияя на транспорт и стабильность белка. Также неясно, выполняет ли свободный домен B30.2, потенциальный промежуточный продукт деградации, отдельную функцию.

Возможно, что специфический процессинг miRNA или мРНК, приводящий к блокировке или преждевременной остановке трансляции, может объяснить усеченные и / или сниженные уровни белка, хотя с помощью RT-PCR не было обнаружено никакого влияния на транскрипты BTN3A1 в линиях повторной экспрессии.Поскольку ингибитор MG132 не дает четкой картины стабилизации белка, как здесь проиллюстрировано стабилизацией NRF2, неясно, является ли нестабильность BTN3A1 следствием функции протеасомы. Лизосомное торможение также не имело эффекта. Следовательно, может быть задействован другой механизм созревания и транспортировки белка, действующий на уровне трансляции белка или встраивания в мембрану.

Контроль стабильности BTN3A1 обеспечит динамический механизм для контроля активации Т-клеток Vγ9 / Vδ2, аналогичный тому, который показан для гомологичной молекулы PD-L1, контролирующей ответы αβ Т-клеток (43).Тот факт, что экспрессия BN3A1, по-видимому, ограничивается по сравнению с BTN3A2, также будет влиять на взаимодействия между двумя изоформами, которые недавно были предложены как важные для активации Т-клеток Vγ9 / Vδ2 (11). Регулирование стабильности BTN3A1 также может предлагать средства для модуляции иммунного надзора с помощью Vγ9 / Vδ2 Т-клеток, представляя потенциальный механизм иммунного уклонения, используемый опухолями и внутриклеточными патогенами.

ABCG2 был идентифицирован как потенциальный белок-кандидат в pAg-зависимой активации Т-клеток с использованием PMP обработанных HMB-PP клеток HeLa-M.ABCG2 функционально коррелирует с популяцией отрицательной по красителю стороны, биомаркером раковых стволовых клеток (44), и считался интересным функциональным кандидатом в презентации pAg из-за известной связи со статинами, метаболизмом холестерина и путем HMG-CoA редуктазы (45, 46). ). Однако клетки с нокдауном shRNA ^ABCG2 не выявили функциональных дефектов в анализах Т-клеток. Возможно, что shРНК не снижала уровни ABCG2 в достаточной степени в клетках HeLa-M ^ABCG2 , чтобы повлиять на этот анализ, или что другие члены семейства транспортеров ABC со сходным профилем экспрессии и субстрата (например, ABCB1) компенсировали его отсутствие в эти клетки.

Помимо ABCG2 и ABCB1, нарушена регуляция транскрипции ABCA1 и ABCG1. ABCA1 и ABCG1 также функционально связаны с метаболизмом холестерина, действуя как регуляторы транспорта холестерина (47, 48). Поскольку неизвестно, что эти молекулы индуцируются провоспалительными цитокинами, неясно, какие сигналы от супернатанта γδ Т-клеток, полученных из сокультуры с клетками HeLa-M, содержащими 10 нМ HMB-PP, индуцировали транскрипцию ABCA1 и ABCG1 в HeLa. -L, но не в HeLa-M.Опубликованные данные описывают роль в активации γδ Т-клеток для ABCA1, действующего вместе с BTN3A1 в качестве переносчика оттока pAg в миелоидных клетках, связанного с фактором транскрипции LXR (X-рецептор печени) (49). В модели оттока ABCA1 (49) ABCA1 направляет IPP во внеклеточный компартмент, чтобы активировать γδ Т-клетки в транс-. В нашей системе экспрессия ABCA1 в активированных клетках HeLa-L теоретически должна снижать внутриклеточную концентрацию HMB-PP, тем самым ограничивая пул, доступный для активации BTN3A1.Однако ABCA1 не усиливал активацию Т-клеток HeLa-M, нагруженным HMB-PP, потому что он, по-видимому, не экспрессировался в этих клетках. Следовательно, только ABCA1 не может объяснить обнаруженные нами эффекты, и также трудно разрешить внеклеточный механизм доставки и восприятия pAg со связыванием pAg с цитозольным доменом B30.2 BTN3A1 (9), если это взаимодействие не способствует экспорту pAg. связывать BTN3A1 извне, как предложено другими исследователями (7, 50).

Обычная ограниченная MHC презентация антигена TCR, экспрессируемой на αβ Т-клетках, зависит от транспорта пептидов гетеродимерным транспортером TAP1 / 2, и вполне вероятно, что транспорт pAg аналогичным образом требует членов семейства ABC.Другие исследователи исследовали ABCC5 (51) в дополнение к ABCA1 (49). Хотя большинство из них описываются как насосы оттока лекарств или ксенобиотиков, вносящие вклад в фенотип множественной лекарственной устойчивости, эндогенные субстраты для многих переносчиков ABC в значительной степени не охарактеризованы. Если задействованы эти ABC-транспортеры, очевидно, что в этой системе больше сложности, чем позволяют существующие модели презентации pAg, в частности, происходит ли транспорт pAg в клетки или из них (или и то, и другое) (50, 52) и влияют ли они на экспрессию BTN3A посредством прямое взаимодействие (49).Представляется оправданным дальнейший анализ этих ABC-транспортеров.

Клетки

HeLa были первой клеточной линией, которая использовалась для биомедицинских исследований, начиная с 1950-х годов (53). HeLa-L и HeLa-M — две сублинии, происхождение которых неясно, но которые, как показывают наши данные, генетически идентичны. В клеточных линиях не было микоплазмы или другой выявляемой инфекции, и случайное наблюдение различий в представлении pAg и взаимодействии с размноженными Т-клетками Vγ9 / Vδ2, полученными от разных доноров, было стабильным в течение более 3 лет с повторными образцами, полученными из исходных источников.Линия HeLa-M исторически показывала повышенный ответ на IFN-γ (54), а в наших руках проявляла устойчивость к противораковому препарату DOX в тесте на уничтожение красителя, эффект в некоторой степени отменялся нокдауном ABCG2. Таким образом, возможный сценарий — отбор противоопухолевым препаратом, таким как DOX, приводящий к мутации ДНК (55), постоянной активации пути стрессового ответа KEAP1 / NRF2 и увеличению экспрессии ABCG2 в этих клетках (56). Аналогичный подход был использован для идентификации ABCG2 из лекарственно-устойчивой линии MCF-7 (57).

Альтернативно, дефекты передачи сигналов пути hedgehog или регуляции транскрипции LXR могут участвовать в экспрессии транспортера ABC (47, 58-60). Если DOX влияет на регуляцию BTN3A-зависимого зондирования pAg, то использование таких цитотоксических препаратов при лечении рака может повлиять на стратегии иммунотерапии, основанные на γδ Т-клетках (23), путем отбора клонов с повышенной экспрессией факторов выживания, которые способствуют росту опухоли. В любом случае экспрессия этого подмножества переносчиков ABC может действовать как биомаркер повышенной активации Т-клеток Vγ9 / Vδ2 секрецией цитокинов, и будет интересно проверить эту корреляцию на других клетках и с другими маркерами активации.Текущие эксперименты продолжаются, чтобы определить более полный каталог различий между клетками HeLa-L и HeLa-M.

Авторские взносы

DR, ME и TH разработали исследования; DR, H-CC, JW, AH, JY, SS, HR и TH провели исследования; DR, ME, H-CC и TH проанализировали данные, JT и PL предоставили емкость; DR и ME написали статью при участии всех авторов.

Заявление о конфликте интересов

Авторам не известно о каких-либо финансовых активах или других личных или профессиональных отношениях, которые могли бы быть истолкованы как влияющие на объективность этой рукописи.

Редактор обработки заявил о прошлом соавторстве с одним из авторов (ME).

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами MRC Project MR / M020290 / 1 и MR / N023145 / 1, Cardiff Incoming Visiting Fellowship (TH) и грантом Wilhelm Sander Stiftung 2013.907.2. TH благодарит Л. Старика и А. Нёрена за отличную техническую помощь.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу https: // www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2018.00662/full#supplementary-material.

Список литературы

3. Нильсен М.М., Уизерден Д.А., Гавран В.Л. Gammadelta T-клетки в гомеостазе и защите хозяина тканей эпителиального барьера. Nat Rev Immunol (2017) 17: 733–45. DOI: 10.1038 / н.в.2017.101

CrossRef Полный текст | Google Scholar

4. Ди Марко Баррос Р., Робертс Н. А., Дарт Р. Дж., Вантуроут П., Джандке А., Нуссбаумер О. и др. Эпителии используют бутирофилин-подобные молекулы для формирования органо-специфических компартментов гаммадельта-Т-клеток. Cell (2016) 167: 203–18.e17. DOI: 10.1016 / j.cell.2016.08.030

CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Сартер К., Леймгрубер Э., Гобет Ф., Агравал В., Дунанд-Саутиер I, Баррас Э. и др. Btn2a2, иммуномодулирующая молекула Т-клеток, корегулируемая генами MHC класса II. J Exp Med (2016) 213: 177–87. DOI: 10.1084 / jem.20150435

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Вавассори С., Кумар А., Ван Г.С., Раманджанеюлу Г.С., Каваллари М., Эль Дакер С. и др.Бутирофилин 3A1 связывает фосфорилированные антигены и стимулирует Т-клетки гаммадельта человека. Nat Immunol (2013) 14: 908–16. DOI: 10.1038 / ni.2665

CrossRef Полный текст | Google Scholar

8. Decaup E, Duault C, Bezombes C, Poupot M, Savina A, Olive D, et al. Фосфоантигены и бутирофилин 3A1 индуцируют аналогичную передачу сигналов внутриклеточной активации в Т-лимфоцитах TCRVgamma9 + gammadelta человека. Immunol Lett (2014) 161: 133–7. DOI: 10.1016 / j.imlet.2014.05.011

CrossRef Полный текст | Google Scholar

9.Sandstrom A, Peigne CM, Leger A, Crooks JE, Konczak F, Gesnel MC, et al. Внутриклеточный домен B30.2 бутирофилина 3A1 связывает фосфоантигены, опосредуя активацию Т-клеток Vgamma9Vdelta2 человека. Иммунитет (2014) 40: 490–500. DOI: 10.1016 / j.immuni.2014.03.003

CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Harly C, Guillaume Y, Nedellec S, Peigne CM, Monkkonen H, Monkkonen J, et al. Ключевое значение CD277 / бутирофилин-3 (BTN3A) в восприятии клеточного стресса основной субпопуляцией гаммадельта-Т-клеток человека. Кровь (2012) 120: 2269–79. DOI: 10.1182 / кровь-2012-05-430470

CrossRef Полный текст | Google Scholar

11. Вантуроут П., Лэйнг А., Вудворд М.Дж., Златарева И., Аполония Л., Джонс А.В. и др. Гетеромерные взаимодействия регулируют бутирофилин (BTN) и BTN-подобные молекулы, управляющие биологией γδ Т-клеток. Proc Natl Acad Sci U S A (2018) 115: 1039–44. DOI: 10.1073 / pnas.1701237115

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Бойден Л.М., Льюис Дж. М., Барби С.Д., Бас А., Жирарди М., Хейдей А.С. и др.Skint1, прототип недавно идентифицированного кластера генов суперсемейства иммуноглобулинов, положительно селектирует эпидермальные гаммадельта-Т-клетки. Нат Генет (2008) 40: 656–62. DOI: 10,1038 / нг.108

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

13. Барби С.Д., Вудворд М.Дж., Турчинович Г., Упоминание Дж. Дж., Льюис Дж. М., Бойден Л. М. и др. Skint-1 — это высокоспецифичный, уникальный компонент отбора эпидермальных Т-клеток. Proc Natl Acad Sci U S A (2011) 108: 3330–5. DOI: 10.1073 / пнас.10108

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

14. Хинц М., Райхенберг А., Алтынчичек Б., Бахр У., Гшвинд Р.М., Коллас А.К. и др. Идентификация (E) -4-гидрокси-3-метил-бут-2-енилпирофосфата как основного активатора гаммадельта-Т-клеток человека в Escherichia coli . FEBS Lett (2001) 509: 317–22. DOI: 10.1016 / S0014-5793 (01) 03191-X

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. Эберл М., Хинц М., Райхенберг А., Коллас А. К., Визнер Дж., Йомаа Х.Биосинтез микробных изопреноидов и активация Т-клеток гаммадельта человека. FEBS Lett (2003) 544: 4–10. DOI: 10.1016 / S0014-5793 (03) 00483-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16. Кастелла Б., Риганти С., Фиоре Ф., Панталеони Ф., Канепари М.Э., Пеола С. и др. Иммунная модуляция золедроновой кислотой при миеломе человека: полезный перекрестный обмен между Т-клетками Vgamma9Vdelta2, алфавитными CD8 + Т-клетками, регуляторными Т-клетками и дендритными клетками. J Immunol (2011) 187: 1578–90.DOI: 10.4049 / jimmunol.1002514

CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Фаулер Д.В., Копир Дж., Далглиш А.Г., Бодман-Смит, Мэриленд. Золедроновая кислота делает человеческие макрофаги M1 и M2 восприимчивыми к цитотоксичности Т-клеток Vdelta2 (+) гаммадельта перфорин-зависимым образом. Cancer Immunol Immunother (2017) 66: 1205–15. DOI: 10.1007 / s00262-017-2011-1

CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Брандес М., Виллиманн К., Биолей Г., Леви Н., Эберл М., Луо М. и др.Кросс-презентирующие Т-клетки гаммадельта индуцируют устойчивые Т-клеточные ответы CD8 + алфавита. Proc Natl Acad Sci U S A (2009) 106: 2307–12. DOI: 10.1073 / pnas.0810059106

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Тайлер С.Дж., Доэрти Д.Г., Мозер Б., Эберл М. Человеческие Т-клетки Vgamma9 / Vdelta2: врожденные адаптеры иммунной системы. Cell Immunol (2015) 296: 10–21. DOI: 10.1016 / j.cellimm.2015.01.008

CrossRef Полный текст | Google Scholar

21.Вильгельм М., Кунцманн В., Экштейн С., Реймер П., Вайссингер Ф., Рюдигер Т. и др. Т-клетки гаммадельта для иммунотерапии больных лимфоидными злокачественными новообразованиями. Кровь (2003) 102: 200–6. DOI: 10.1182 / кровь-2002-12-3665

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Меравилья С., Эберл М., Вермейлен Д., Тодаро М., Буккери С., Цицеро Г. и др. Манипуляции in vivo Т-клетками Vgamma9Vdelta2 с золедронатом и низкими дозами интерлейкина-2 для иммунотерапии пациентов с распространенным раком груди. Clin Exp Immunol (2010) 161: 290–7. DOI: 10.1111 / j.1365-2249.2010.04167.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Гертнер-Дарденн Дж., Кастеллано Р., Мамесье Э., Гарбит С., Кочбати Э., Этьен А. и др. Человеческие Т-клетки Vgamma9Vdelta2 специфически распознают и убивают острые миелоидные лейкозные бласты. J Immunol (2012) 188: 4701–8. DOI: 10.4049 / jimmunol.1103710

CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Ханнани Д., Ма И, Ямазаки Т., Дечанет-Мервиль Дж., Кремер Дж., Зитвогель Л.Использование Т-клеток гаммадельта в противоопухолевой иммунотерапии. Trends Immunol (2012) 33: 199–206. DOI: 10.1016 / j.it.2012.01.006

CrossRef Полный текст | Google Scholar

26. Хан М.В., Эберл М., Мозер Б. Потенциальное использование вакцин на основе Т-клеток гаммадельта в иммунотерапии рака. Front Immunol (2014) 5: 512. DOI: 10.3389 / fimmu.2014.00512

CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Маккарти Н. Э., Хедин Ч. Р., Сандерс Т. Дж., Амон П., Хоти И., Аяда И. и др.Азатиоприновая терапия избирательно удаляет человеческие Vdelta2 (+) Т-клетки при болезни Крона. Дж. Клин Инвест (2015) 125: 3215–25. DOI: 10.1172 / JCI80840

CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Папотто PH, Рейнхардт А., Принц И., Сильва-Сантос Б. Врожденная универсальность: Т-клетки гаммадельта17 при воспалительных и аутоиммунных заболеваниях. J Autoimmun (2018) 87: 26–37. DOI: 10.1016 / j.jaut.2017.11.006

CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Беньямин А., Ле Рой А., Мамесье Э., Гертнер-Дарденн Дж., Кастанье С., Орландуччи Ф. и др.Молекулы BTN3A значительно улучшают иммунотерапию на основе клеток Vgamma9Vdelta2T при остром миелоидном лейкозе. Онкоиммунология (2016) 5: e1146843. DOI: 10.1080 / 2162402X.2016.1146843

CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Родс Д.А., Чен Х.С., Прайс А.Дж., Кибл А.Х., Дэйви М.С., Джеймс Л.С. и др. Активация Т-клеток гаммадельта человека цитозольным взаимодействием BTN3A1 с растворимыми фосфоантигенами и периплакином адаптера цитоскелета. J Immunol (2015) 194: 2390–8.DOI: 10.4049 / jimmunol.1401064

CrossRef Полный текст | Google Scholar

31. Уикес М.П., ​​Томасек П., Хаттлин Е.Л., Филдинг Калифорния, Нусинов Д., Стэнтон Р.Дж. и др. Количественная временная виромика: подход к исследованию взаимодействия хозяина-патогена. Cell (2014) 157: 1460–72. DOI: 10.1016 / j.cell.2014.04.028

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

32. Старик Л., Риано Ф., Карунакаран М.М., Кунцманн В., Ли Дж., Крайсс М. и др. Бутирофилин 3A (BTN3A, CD277) -специфические антитела 20.1 дифференциально активирует клонотипы TCR Vgamma9Vdelta2 и препятствует активации фосфоантигена. Eur J Immunol (2017) 47: 982–92. DOI: 10.1002 / eji.201646818

CrossRef Полный текст | Google Scholar

33. Себастьен З., Шепер В., Выборова А., Гу С., Рихнавская З., Шиффлер М. и др. RhoB опосредует распознавание фосфоантигена Т-клеточным рецептором Vgamma9Vdelta2. Cell Rep (2016) 15: 1973–85. DOI: 10.1016 / j.celrep.2016.04.081

CrossRef Полный текст | Google Scholar

34.Groot KR, Sevilla LM, Nishi K, DiColandrea T, Watt FM. Казрин, новый взаимодействующий с периплакином белок, связанный с десмосомами и плазматической мембраной кератиноцитов. J Cell Biol (2004) 166: 653–9. DOI: 10.1083 / jcb.200312123

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

35. Бочонади В., Макинрой Л., Маатта А. Перекрестный разговор цитолинкеров: N-конец периплакина взаимодействует с плектином, чтобы регулировать организацию кератина и миграцию эпителия. Exp Cell Res (2007) 313: 3579–91.DOI: 10.1016 / j.yexcr.2007.07.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

36. Севилья Л. М., Начат Р., Грут К. Р., Клемент Дж. Ф., Уитто Дж., Джиан П. и др. Мыши с дефицитом инволюкрина, энвоплакина и периплакина имеют дефектный эпидермальный барьер. J Cell Biol (2007) 179: 1599–612. DOI: 10.1083 / jcb.200706187

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

37. Депутат Уикес, Антробус Р., Лилл Дж. Р., Дункан Л. М., Хор С., Ленер П. Дж..Сравнительный анализ методов очистки белков плазматической мембраны. J Biomol Tech (2010) 21: 108–15.

PubMed Аннотация | Google Scholar

38. Уикес М.П., ​​Тан С.Ю., Пул Э., Талбот С., Антробус Р., Смит Д.Л. и др. Связанная с латентностью деградация переносчика лекарств MRP1 во время латентной цитомегаловирусной инфекции человека. Наука (2013) 340: 199–202. DOI: 10.1126 / science.1235047

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

39.Дойл Л.А., Ян В., Абруццо Л.В., Крогманн Т., Гао Ю., Риши А.К. и др. Переносчик множественной лекарственной устойчивости из клеток рака молочной железы человека MCF-7. Proc Natl Acad Sci U S. A (1998) 95: 15665–70. DOI: 10.1073 / pnas.95.26.15665

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

40. Джи Х., Ли Дж. Х., Ван И, Панг И, Чжан Т., Ся И и др. EGFR фосфорилирует FAM129B, способствуя активации Ras. Proc Natl Acad Sci U S A (2016) 113: 644–9. DOI: 10.1073 / pnas.1517112113

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

41.Маллери Д.Л., Макьюэн В.А., Бидгуд С.Р., Тауэрс Г.Дж., Джонсон С.М., Джеймс Л.К. Антитела опосредуют внутриклеточный иммунитет через тройной мотив, содержащий 21 (TRIM21). Proc Natl Acad Sci U S A (2010) 107: 19985–90. DOI: 10.1073 / pnas.1014074107

CrossRef Полный текст | Google Scholar

42. Hsu JL, van den Boomen DJ, Tomasec P, Weekes MP, Antrobus R, Stanton RJ, et al. Профилирование плазматической мембраны определяет расширенный класс белков клеточной поверхности, избирательно нацеленных на деградацию HCMV US2 в сотрудничестве с UL141. PLoS Pathog (2015) 11: e1004811. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1004811

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

43. Берр М.Л., Спарбир С.Е., Чан Ю.К., Уильямсон Дж. К., Вудс К., Бивис П.А. и др. CMTM6 поддерживает экспрессию PD-L1 и регулирует противоопухолевый иммунитет. Nature (2017) 549: 101–5. DOI: 10.1038 / природа23643

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

44. Zhou S, Schuetz JD, Bunting KD, Colapietro AM, Sampath J, Morris JJ, et al.ABC-транспортер Bcrp1 / ABCG2 экспрессируется в большом количестве стволовых клеток и является молекулярным детерминантом фенотипа боковой популяции. Nat Med (2001) 7: 1028–34. DOI: 10,1038 / нм0901-1028

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

45. Томлинсон Б., Ху М., Ли В. В., Луи С. С., Чу Т. Т., Пун Э. У. и др. Полиморфизм ABCG2 связан с реакцией холестерина липопротеинов низкой плотности на розувастатин. Clin Pharmacol Ther (2010) 87: 558–62.DOI: 10.1038 / clpt.2009.232

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

46. Ху М., То К.К., Мак В.В., Томлинсон Б. Переносчик ABCG2 и его связь с фармакокинетикой, взаимодействием лекарств и гиполипидемическими эффектами статинов. Мнение эксперта Drug Metab Toxicol (2011) 7: 49–62. DOI: 10.1517 / 17425255.2011.538383

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

47. Канеко Т., Канно С., Итикава-Томикава Н., Касиваги К., Ягинума Н., Окоши С. и др.Х-рецептор печени снижает пролиферацию раковых клеток ротовой полости человека, способствуя оттоку холестерина за счет усиления экспрессии ABCA1. Oncotarget (2015) 6: 33345–57. DOI: 10.18632 / oncotarget.5428

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

49. Castella B, Kopecka J, Sciancalepore P, Mandili G, Foglietta M, Mitro N, et al. АТФ-связывающий кассетный транспортер A1 регулирует высвобождение фосфоантигена и активацию Т-клеток Vgamma9Vdelta2 дендритными клетками. Нац Коммун (2017) 8: 15663. DOI: 10.1038 / ncomms15663

CrossRef Полный текст | Google Scholar

50. Де Либеро Г., Лау С.Ю., Мори Л. Презентация фосфоантигена клеткам гаммадельта TCR — загадка, заключающаяся в уменьшении количества серых зон. Front Immunol (2014) 5: 679. DOI: 10.3389 / fimmu.2014.00679

CrossRef Полный текст | Google Scholar

51. Kistowska M. Распознавание антигенов и тимусное созревание клеток TCR Vgamma9-Vdelta2 человека . Ph.Докторская диссертация, Базель: Базельский университет (2007).

Google Scholar

52. Gu S, Nawrocka W., Adams EJ. Чувствительность метаболитов пирофосфата Т-клетками Vgamma9Vdelta2. Front Immunol (2014) 5: 688. DOI: 10.3389 / fimmu.2014.00688

CrossRef Полный текст | Google Scholar

53. Adey A, Burton JN, Kitzman JO, Hiatt JB, Lewis AP, Martin BK, et al. Разрешенный гаплотип геном и эпигеном анеуплоидной линии раковых клеток HeLa. Nature (2013) 500: 207–11.DOI: 10.1038 / природа12064

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

54. Тивари Р.К., Кусари Дж., Сен Г.К. Функциональные эквиваленты опосредованных интерфероном сигналов, необходимых для индукции мРНК, могут генерироваться двухцепочечной РНК и факторами роста. EMBO J (1987) 6: 3373–8.

PubMed Аннотация | Google Scholar

55. Calcagno AM, Fostel JM, To KK, Salcido CD, Martin SE, Chewning KJ, et al. Одностадийные раковые клетки, отобранные с помощью доксорубицина, сверхэкспрессируют переносчик лекарств ABCG2 за счет эпигенетических изменений. Br J Cancer (2008) 98: 1515–24. DOI: 10.1038 / sj.bjc.6604334

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

57. Дойл Л., Росс Д.Д. Множественная лекарственная устойчивость, опосредованная белком устойчивости к раку груди BCRP (ABCG2). Онкоген (2003) 22: 7340–58. DOI: 10.1038 / sj.onc.1206938

CrossRef Полный текст | Google Scholar

58. Сингх Р.Р., Кункалла К., Ку С., Шлетт Э., Нилапу С.С., Саманьего Ф. и др. ABCG2 является прямой мишенью транскрипции для передачи сигналов hedgehog и участвует в индуцированной стромой лекарственной устойчивости при диффузной большой B-клеточной лимфоме. Онкоген (2011) 30: 4874–86. DOI: 10.1038 / onc.2011.195

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

59. Чен Й, Бибер М.М., Тэн Н.Н. Передача сигналов Hedgehog регулирует чувствительность к лекарствам, воздействуя на транспортеры ABC ABCB1 и ABCG2 при эпителиальном раке яичников. Mol Carcinog (2014) 53: 625–34. DOI: 10.1002 / mc.22015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

60. Ито А., Хонг К., Ронг Х, Чжу Х, Тарлинг Э. Дж., Хедде П. Н. и др.LXR связывают метаболизм с воспалением посредством Abca1-зависимой регуляции состава мембраны и передачи сигналов TLR. Элиф (2015) 4: e08009. DOI: 10.7554 / eLife.08009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Офис будущего Устранение барьеров для продуктивности | Блог

От сокращающих время ярлыков и подключения к виртуальной помощи, устранение барьеров производительности еще быстрее приближает нас к офису будущего.

Преодоление самого большого препятствия

Технологии помогают нам преодолеть самый большой барьер, с которым когда-либо сталкивались люди — расстояние и время.

Там, где современные инструменты бизнес-конференции предоставляют сложные способы входа в систему, обмена презентациями, планами, идеями и даже мозгового штурма на разных континентах — мы только начинаем понимать поверхность как с точки зрения технических возможностей, так и с точки зрения требований бизнеса.

Фирмы-новаторы уже проводят конференции по виртуальной реальности (VR). Настройки могут быть такими же разнообразными, как пляжи и космос. Некоторые технические эксперты считают, что это может стать гораздо более распространенным уже через 5 лет ¹ .

Функциональность

VR и дополненной реальности (AR) поможет уменьшить чувство неловкости, расширяя возможности сотрудничества и помогая участникам взаимодействовать с реальными материалами, продуктами или концепциями, чтобы усилить ощущение присутствия.

Эти виртуальные миры можно было бы даже спроектировать для стимулирования творчества и развития потенциала технологии.

Создание виртуальной подключенной рабочей экосистемы

В ближайшем будущем технологии будут исключены из разрозненности и будет создана виртуальная подключенная рабочая экосистема.

Благодаря безопасному облачному доступу и взаимодействию, ИТ-системы и интеллектуальные офисные устройства, такие как многофункциональные устройства печати (МФУ), будут объединены в сеть и будут взаимодействовать друг с другом2. Это радикально изменит способ нашей работы и откроет неисчислимые рабочие свободы, просто обеспечив беспрепятственный, безопасный, связанный и интуитивно понятный технологический опыт.

Обогащенный технологией, которая впервые используется в потребительском мире с помощью виртуальных помощников, таких как Alexa, Cortana и Siri, офисные устройства и системы будут разработаны с биометрическим доступом, распознаванием голоса, поддержкой звука, настройкой с видео-инструкциями и самодиагностикой.

Интеллектуальные технологии, такие как МФУ, также смогут предугадывать потребности пользователей и заботиться о себе, переупорядочивая детали или запасные части, чтобы максимально увеличить время безотказной работы, устраняя еще один барьер для производительности. Такая технология также будет способствовать прогнозируемому росту контрактных моделей поставки ИТ и офисного оборудования, включая услуги управляемой печати (MPS).

Преодоление горизонтальных барьеров продуктивности

Technology предлагает нечто гораздо более захватывающее, чем ярлыки, более простые взаимодействия и сокращение расстояния и времени — они обещают помочь нам преодолеть наши собственные интеллектуальные ограничения человека.

Искусственный интеллект (ИИ) скоро произведет революцию в мире труда. Подключенные устройства, собирающие информацию и применяющие алгоритмы, скоро начнут предлагать решения проблем производительности, во многих случаях преодолевая проблемы, которые люди даже не выявили.

Чтобы помочь нам преодолеть ограничения производительности, прогнозируется, что виртуальные помощники будут управлять календарями, бронировать конференц-залы и заполнять формы расходов к 2025 году ² . Такие программы, как Start Compose for Gmail от Google, будут постоянно улучшать составление автоматических ответов по электронной почте.

На уровне отдела системы автоматически выполняют ранее выполняемые вручную задачи, такие как выставление счетов, обработка заказов клиентов и расчет заработной платы.

Technology становится все более популярной в офисе по мере того, как устраняются препятствия для продуктивности. Так где же люди в этой все более продуктивной работе?

Благодаря автоматизации все большего количества черных и повторяющихся задач работники станут более свободными для выполнения более стратегических, критически важных для бизнеса задач и задач с добавленной стоимостью, помогая предприятиям повысить производительность и прибыльность.

1 https://www.fastcompany.com/40447437/will-virtual-reality-solve-your-conference-calls-nightmares
2 Quocirca Print 2025

Сила музыки | Hispanic Studies

Воскресным утром я проснулся и узнал, что Уитни Хьюстон скончалась.

(Фотография предоставлена: Блог размера не имеет значения)

Признаюсь, об этом мне говорила не газета, а скорее обновления статуса Facebook друзей, которые ею восхищаются. Такие обновления, как «Итак, Уитни умерла… вздох» и ссылки на ее исполнение «Мост через мутную воду» с Сес Уильямс, заставили меня задуматься о том, что же произошло.Когда я читал и узнал, что она умерла в возрасте 48 лет, я был глубоко опечален. Ее музыка была музыкой моей юности, и часто я не ложился спать задолго до сна, чтобы послушать ее альбомы на кассетах (да, кассетных!). Это были одни из первых кассет, которые у меня когда-либо были. В некоторых новостях использовалось сопоставление, чтобы предположить, что ее смерть наступила от передозировки наркотиков, как и многие из злополучных звезд до нее (вспомните Элвиса Пресли, Джима Моррисона, Эми Уайнхаус, как отмечено в этой статье из времен Индии).

Но мне пришло в голову другое сопоставление. В 2003 году я вернулся в Израиль, чтобы продолжить свое исследование идентичности чернокожих евреев, и в рамках этой поездки я провел некоторое время с чернокожими евреями-израильтянами в Димоне. Моему визиту предшествовал визит Уитни. Ее визит стал отправной точкой и предметом гордости для общины, да и вообще для всего Израиля. Об этом тогда писали в «Гаарец», и теперь об этом вспомнил не только я.

Вы можете услышать, как Хьюстон и израильтяне поют афроамериканскую духовную песню «Джошуа, пригодный для битвы при Иерихоне» в конце этого видео (послушайте конец, это происходит примерно через 2 минуты после того, как она и Бобби Браун погружаются в воду). ощутите энтузиазм, который она привнесла в так называемую «Землю Обетованную», и то волнение, которое она вызвала по прибытии.

В иудаизме пустыня представляет собой пустыню, место, где главные герои Библии сталкиваются с трудностями и претерпевают значительные духовные преобразования (вспомните Моисея, израильтян — добрых 40 лет странствий …). Как сообщали СМИ, Уитни Хьюстон не новичок в этом рассказе, поскольку она тоже отправилась в пустыню, чтобы найти своего рода духовную связь.

Как ни странно, позже в воскресенье мы с Джимом снова услышали это духовное исполнение, на этот раз вживую, U.С. сопрано Николь Тейлор, которая пела вместе с хором девочек (и двух мальчиков!) Института Магнификат в аудитории Монастыря Святого Спасителя, прямо у Новых ворот Старого города. Это мероприятие было проведено в честь Месяца афроамериканской истории благодаря культурному центру Америки при Генеральном консульстве США и Институту Магнификат.

(Фото предоставлено: Africlassical Blog. Больше фотографий мероприятия, включая детский хор на Demotix)

Было захватывающе сидеть в зале с окном, выходящим на стены Старого города слева от нас, комната была забита Е.Иерусалимцы, американцы, гордые родители выступающих детей, дипломаты из консульства и другие, кто слышал о мероприятии. Там мы слушали молодых мальчиков и девочек, которые были примерно того возраста, в котором я впервые обнаружил Уитни Хьюстон, только они пели прекрасные песни о любви на арабском языке. [Послушайте здесь короткий звуковой клип — к сожалению, мне потребовалась минута, чтобы понять, как использовать функцию видео на карманной камере, поэтому он обрезан и не включает совершенно потрясающее соло одной из молодых женщин.Надеюсь, кто-то еще разместит видео, на которые я могу ссылаться позже).

Ни один сотовый телефон не осмелился завибрировать, не говоря уже о звонке. Это был один из немногих случаев, когда мы были в этой части мира, когда красота настоящего момента не нарушалась такими прерывающими вторжениями. Г-жа Тейлор дала несколько объяснений перед тем, как начать свое выступление афроамериканских спиричуэлов. Сначала она спела сама, потом с детьми, а затем пригласила публику принять участие в моде «звонок-ответ».Она открылась песней «This Little Light of Mine» в сопровождении пианиста и американского дипломата Дэниела Эрнста. Вместе с детьми и публикой она спела «Не слышу никого молиться».

Звук моей камеры не соответствует ее голосу или голосам детей, а также не может передать ощущение целой комнаты людей, объединяющих свои голоса, чтобы издавать красивые звуки, в месте, где прямо за Новыми воротами Вы можете увидеть, как израильские солдаты проверяют удостоверения личности, а в нескольких кварталах от недавно действовавшего скоростного трамвая кружит вверх и вниз по старой Яффо-стрит.Но за те полтора часа, что мы были в зале, музыка превзошла все это, унося нас в место абсолютной красоты и трепета. Г-жа Тейлор говорила об универсальных посланиях афроамериканских духовных людей о стойкости человеческого духа, и ее голос напомнил мне о силе песни. В месте, где виден разделительный барьер, а сам Иерихон находится всего в 43,4 км или 17 милях от Западного берега, слова «и стены рушатся» из «Джошуа, пригодного для битвы при Иерихоне» звучат иначе. , но не менее мощный набор значений.

Я начал этот пост с обсуждения сопоставления и утраты, и в заключение я повторю свое заявление о способности музыки подавлять и превосходить, даже если только на мгновение. Уитни Хьюстон, чьи песни «How Will I Know», «Greatest Love of All» и «I Wanna Dance with Someone» запечатлелись в сердцах многих, будет очень не хватать. Я надеюсь, что мое свидетельство о силе песни в месте, в котором нет недостатка в красоте, но я уверен, что можно было бы использовать немного больше гармонии (плохой каламбур), будет подходящим памятником для любимой поп-дивы.

Выдача (например, денежная кассета) Патенты и заявки на патенты (Класс 902/13)

Номер патента: 8887995

Реферат: Изобретение относится к устройствам (10, 50, 60, 200) для обработки ценных бумаг.Устройство (10, 50, 60, 200) содержит радиоблок (20) для отправки данных от устройства (10, 50, 60, 200) в сервисный блок (22) через мобильную радиосвязь (24). Кроме того, устройство (10, 50, 60, 200) имеет сейф (12, 202), в котором размещается по меньшей мере одна кассета для наличных денег (14a, 14b, 100, 204a, 204b). Кассета для наличных денег (14a, 14b, 100, 204a, 204b) содержит память данных аутентификации (18a, 18b, 106, 208a, 208b), в которой данные аутентификации для однозначной аутентификации кассеты для наличных денег (14a, 14b, 100, 204a) , 204b) блоком обслуживания (22).Радиоблок (20) передает аутентификационные данные и данные о запасах с информацией о текущем запасе денежных знаков в кассете для наличных (14a, 14b, 100, 204a, 204b) в сервисный блок (22) по мобильной радиосвязи (24). ). Другой аспект изобретения относится к кассете для наличных денег (100, 204a, 204b) для хранения ценных бумаг.

Тип:
Грант

Зарегистрирован:
27 августа 2010 г.

Дата патента:
18 ноября 2014 г.

Цессионарий:
Wincor Nixdorf International GmbH

Изобретатель:

Иоахим Зайберт

.