Регенерация арагон 2 инструкция: Регенерация картриджа Арагон

Регенерация арагон 2 инструкция: Регенерация картриджа Арагон

Содержание

Регенерация Арагон, регенерация картриджей Гейзер Арагон, инструкция по очистке

<< фильтры для воды >><< картриджи >> << картриджи Гейзер >><< Регенерация Арагон Статья
 
 
      
  

 Механическая очистка. Замена дозатора.  
 
Раскрутить входящим в комплект поставки ключом второй корпус, и вывернуть картридж Арагон.
Вылить из него воду (у Арагон-М специальным ключом вывернуть донную заглушку, извлечь при необходимости дозатор, ввернуть заглушку до упора) и очистить внешнюю поверхность картриджа мягкой щеткой (например платяной) под струей воды. При замене картриджа Арагон достать из использованного картриджа вставку В и переставить в новый картридж, снять крышку нового дозатора, вставить его открытой стороной вверх и ввернуть донную заглушку до упора.
Собрать фильтр в обратном порядке и промыть его 1-2 минуты.

   
 

 
* У Арагон-М специальным ключом вывернуть донную заглушку, извлечь и заменить при необходимости дозатор, ввернуть заглушку до упора

 

Очистка от солей жесткости

 Регенерация  (проводится после механической очистки)
 
Приготовить раствор для регенерации. В емкость 1,5-2 л насыпать 40 г лимонной кислоты, 30 г (2 столовые ложки) соды и залить 1л воды. Заливать воду следует в несколько приемов, поскольку при этом происходит вспенивание (выделение углекислого газа).
Установить картридж в корпус и полностью залить его приготовленным раствором (примерно 0,6 л).
Оставить на 10-12 часов, после чего вынуть картридж и вылить отработанный раствор.
Поставить картридж вертикально в мойку и пролить через него оставшийся раствор, заливая внутрь через резьбовую горловину и дать полностью стечь.
Вымыть водой остатки раствора из картриджа в два этапа. Сначала 3 литра воды залить порциями до самого верха картриджа через резьбовую горловину. Затем обернуть горловину полиэтиленовой пленкой и закрепить её резинкой или бечевкой.
Перевернуть и выкрутить соответствующим ключом донную заглушку.
Поставить в мойку в этом положении вертикально и пролить ещё 3 литра воды, как описано выше.
Снять пленку и ввернуть на место донную заглушку.
Собрать фильтр в обратном порядке.
Открыть кран для чистой воды и промыть фильтр водой со скоростью 1-1,5 л/мин в течение 3 мин.

 

       

* Перед сборкой смажьте уплотнительное кольцо (рис. 2 поз. 6) вазелином или силиконовой смазкой (не путать с герметиком!).
 
Очистка от солей железа

Регенерация (проводится после механической очистки)
 
В эмалированной или стеклянной посуде приготовить 3 литра горячего 3% раствора лимонной кислоты (40 г. или 2 столовые ложки на литр воды)

 

Поставить картридж в мойку или соответствующую емкость на подставку и проливать через него приготовленный раствор, заливая его внутрь картриджа Арагон через резьбовую горловину порциями до самого верха до тех пор, пока выходящий из него раствор не станет чистым и прозрачным.
Приготовить 0.6л 2% раствора питьевой соды (1 чайная ложка соды на 0.6 л).
Установить картридж Арагон в корпус и залить внутрь раствор соды. Заливать раствор нужно через горловину картриджа, до тех пор, пока он весь и корпус не заполнятся раствором.
Через час вылить раствор и собрать фильтр в обратном порядке.* Открыть кран чистой воды и пролить воду в течение 5 минут.
Фильтр готов к работе.

Регенерация фильтра для воды — инструкция к процессу

Фильтры для воды стали обязательным очищающим элементом в квартирах и загородных домах, а также на предприятиях.

Они, как и любая другая техника, нуждаются в обслуживании, в частности, особенного внимания заслуживает процедура регенерации картриджей с ионообменной смолой.

И если в одноступенчатых устройствах, а также фильтрах-насадках и кувшинах использованный картридж просто меняют на новый, с трехступенчатыми все сложнее.

Они состоят из картриджа механической очистки, доочистки угля и картриджа с ионообменной смолой. В связи с большим ресурсом работы устройства их нужно обслуживать или менять единожды в год.

Фильтр будет функционировать нормально, при одном условии — если будет проводиться регулярная регенерация, то есть восстановление свойств ионообменной смолы.

Технология регенерации смолы — как восстанавливается ионообменная смола в фильтре


Ионообменная смола представляет собой мелкие шарики янтаря, которые преобразовывают ионы магния и кальция в ионы натрия. Таким образом, вода становится менее жесткой, на бытовой технике не образуется накипь.

Зная показатели жесткости воды, можно прогнозировать примерный ресурс картриджа со смолой. Для этого показатель емкости делят на показатели жесткости воды, выраженные в мг-экв/литр.

Поглощение ионов магния и кальция – это обратимый процесс. При избыточном содержании ионов натрия будет обратная ситуация, то есть пойдет отдача ионов магния и кальция и поглощение ионов натрия.

Чтобы этого избежать, прибегают к так называемой регенерации, то есть восстановлению функций ионообменной смолы, чтобы она могла послужить вашему фильтру еще некоторое время.

Как проходит технология по регенерации смолы

Запустить процесс регенерации поможет обычная поваренная соль, так как эффективность регенерации фильтров солью давно доказана на практике.

Процесс регенерации может проводиться многократно, но смола все же постепенно начинает терять свои свойства за счет обогащения воды примесями, и рано или поздно ионообменную смолу придется менять.

В целом порядок проведения регенерации выглядит следующим образом:


  • перекрыть поступление воды,
  • включить кран, чтобы стравить давление,
  • вынуть картридж механической очистки, вымыть его, а также колбу, поставить на место,

Для регенерации системы без картриджа:

  • вынуть ионообменный картридж и пересыпать содержимое в кастрюлю или другую емкость,
  • залить смолу солевым раствором и оставить на 6-8 часов, периодически перемешивая,
  • промыть смолу несколько раз чистой водой,

Для регенерации системы с картриджем раствор заливают внутрь и выдерживают 8 часов, затем его сливают и повторяют процедуру;

  • после чего смолу нужно промыть кипяченой водой,
  • установить картридж на место,
  • вынуть картридж с углем, выполнить промывку, поставить на место,
  • включить воду и пропустить несколько минут, пока из воды не пропадет солевой привкус.

Вместо соли также могут использоваться питьевая сода и даже лимонная кислота.

Как провести регенерацию ионообменной смолы в фильтре Гейзер


Компания «Гейзер» — один из лидеров на отечественном рынке фильтров. Рассмотрим, как выполнить регенерацию в трехступенчатый моделях этого производителя.

  1. Перекрыть поступающую в устройство воду.
  2. Спустить давление, открыв кран.
  3. Выполнить механическую очистку фильтра.
  4. Подготовить 10% раствор поваренной соли. Емкость лучше взять больше, так как начнется процесс вспенивания.
  5. Держать устройство над раковиной и заливать 2 литрами солевого раствора так, чтобы смола не пролилась наружу.
  6. Установить картридж обратно в корпус и залить 0,5 л раствора до верха, оставить на 8-10 часов.
  7. Вынуть устройство и дать стечь раствору, затем еще раз залить 2 литра солевого раствора.
  8. После того, как раствор стечет, установить картридж обратно в корпус.
  9. Собрать фильтр.
  10. Включить воду на несколько минут, чтобы из воды пропал привкус соли.

Регенерация сменного модуля фильтров Аквафор


Регенерация позволяет восстанавливать свойства картриджей B510-04 и KH.

Сменный модуль KH для систем Кристалл

1. Перекрыть воду, выпустить давление.
2. Вынуть KH, нажимая кнопку на крышке устройства.
3. Собрать идущий в комплекте переходник для регенерации или приобрести отдельно.
4. Отрезать дно бутылки из пластика и закрепить на переходнике.
5. Сделать раствор 2-2,5 литра поваренной соли.
6. Устройство с бутылкой и переходником поместить в кастрюлю, трубку переходника вывести в раковину.
7. Пропустить через смолу солевой раствор, а затем 2 литра чистой воды.
8. Установить устройство на место.

Модуль B510-04 для систем Трио

1. Отключить подачу воду и стравить давление.
2. Вынуть картридж.
3. Высыпать содержимое в емкость из пластика или металла.
4. Приготовить литровый раствор соли и залить содержимое картриджа, оставить на 6 часов, иногда помешивая.
5. Слить раствор и выполнить промывку кипяченой водой. Повторить процедуру дважды.
6. Поместить содержимое обратно в картридж и поставить его на место.
7. Не забыть о промывке механического картриджа.
8. Включить фильтр на 10 минут, после чего им можно вновь пользоваться.

Инструкция по регенерации картриджа фильтра Арагон

  1. Перекрыть воду, спустить давление.
  2. Приготовить раствор из 40 г лимонной кислоты и двух столовых ложек соды на один литр воды. Так как происходит вспенивание, посуда для раствора должна быть емкостью 1,5-2 литра. Воду нужно наливать постепенно.
  3. Картридж Арагон поставить в корпус, залить его раствором в количестве 0,6 л. Оставить на 12 часов, затем достать картридж и слить раствор.
  4. Далее потребуется дополнительная обработка оставшимся раствором. Делать это лучше над раковиной. Жидкость льют через горловину и оставляют до полного стекания.
  5. Затем нужно промыть устройство. Для этого используют сначала 3 литра чистой воды, которую заливают через горловину. Затем пленкой фиксируют ее и удаляют донную заглушку. Удерживая картридж вертикально, вливают еще 3 литра воды, после чего пленку удаляют, заглушку ставят на место. Останется поставить картридж на свое место в фильтре и включить устройство на несколько минут для промывки.

ВИДЕО ИНСТРУКЦИЯ


Таким образом, используя эту технологию, можно в домашних условиях без приобретения дорогостоящих средств, а лишь с использованием обычной соли можно неоднократно восстанавливать свойства ионообменных картриджей для вашего фильтра.

ГЕЙЗЕР 3 ИВ Люкс 66021 инструкция по эксплуатации онлайн страница 3

3

технолоГИИ Гейзер

арагон – принципиально новый, уникальный, фильтрующий полимер, сочетающий в 

себе три метода фильтрации: механический, сорбционный и ионообменный (Патент 

№2203721). 

Преимущества арагон:
регенерация
  (восстановление)  в  домашних  условиях,  значительно  увеличивает 

ресурс и срок службы.
Полная  безопасность  —  сложная  лабиринтная  структура  фильтроматериала 

необратимо задерживает все примеси (антисброс).
самоиндикация  —  снижение  напора  воды  в  кране  сигнализирует  об  окончании 

ресурса картриджа.
активное  серебро интегрировано в картридж в несмываемой форме -абсолютно 

безопасный бактериостатический эффект.
квазиумягчение  —  в  процессе  фильтрации  воды  через  картридж  арагон  соли 

жесткости преобразуются в полезную форму кальция — арагонит (профилактика 

сердечно-сосудистых заболеваний). очищенная вода при кипячении не образует 

накипи на нагревательных элементах.
Безопасность  –  все  материалы,  используемые  в  водоочистительных  системах 

Гейзер сертифицированы для контакта с пищевой водой и продуктами.

Гарантия от протечек – система испытана давлением в 25 атм.
Минерализация  —  дозатор  микроэлементов  (Патент  №2212378)  позволяет 

автоматически насыщать воду полезными минералами в необходимой концентрации. 

используется в системах для мягкой воды (

арагон М+в(Ca)).

назнаЧенИе

Стационарный  фильтр  для  воды  Гейзер-3  предназначен  для  очистки 

водопроводной  воды  от  вредных  примесей:  хлора,  тяжелых  металлов,  нитратов, 

пестицидов,  взвешенных  частиц,  избытка  солей  жёсткости  и  для  корректировки 

минерального состава.

МодИфИкацИИ И коМПлектацИя фИльтроВ картрИджаМИ

Модель

Первая 

ступень

Вторая ступень

третья 

ступень

корпус

Применение

зив люкс

ррY, ПфМ, рр. арагон М+в(Ca)

СвС

белый

мягкая вода

зив Элита

ррY, ПфМ, рр. арагон М+в(Ca)

ММв/

CвСAg

белый

мягкая вода

ррY, ПфМ, рр. арагон М+в(Ca)

СвС

прозрачный

мягкая вода

зивж люкс ррY, ПфМ, рр. арагон 2

СвС

белый

жесткая вода

зивж 

Элита

ррY, ПфМ, рр. арагон 2

ММв/

CBCAg

белый

жесткая вода

3иж

ррY, ПфМ, рр. арагон 2

СвС

прозрачный жесткая вода

зк люкс

ба

арагон

СвС

белый

железистая 

вода

зак Элита

ба

арагон

ММв/ 

СвСAg

позрачный

железистая 

вода

Обзор фильтра Гейзер

Представляем вашему вниманию фильтр Гейзер.

По заверению производителя фильтр удаляет 99,999% ротавирусов, полиовирусов, вирусов гепатита А, сальмонеллы и легионеллы. Процент очистки от остальных вирусов тоже составляет 99,999%. Какой вирус входит в 0.001% производитель умолчал.

Нет никакой информации от удаления частиц полиэтилена, о котором так много сейчас говорят экологи всего мира.


Температура воды не более 40 градусов.

Максимальное рабочее давление 6 атм.

производительность 3 л/мин

 

Фильтр в продаже уже достаточно давно, многие знакомы с ним, но и много вопросов задается по нему в наших  магазинах «Российская сантехника»

Итак, начнем. Фильтр поставляется в красивой, удобной упаковке, где подробно расписаны все преимущества данного фильтра. 

 На обзор мы взяли  трехступенчатый фильтр в классическом исполнении «Гейзер Классик» «жесткая вода». На самом деле, у производителя есть несколько типов данного фильтра, которые «заточены» под следующие типы воды:

    • Мягкая вода
    • Жесткая вода
    • Повышенное содержание солей жесткости
    • Повышенное содержание железа

 В городе Тверь, хоть  показатели и отличаются от района к району, но судя по пробам, главная проблема города- это все таки много растворенного железа в воде.

Для справки: «Растворенное железо, (оно же двухвалентное железо), находится в воде в растворенном виде, при этом  вид у воды прозрачный, но стоит этой воде немного соприкоснуться с кислородом в воздухе, двухвалентное железо превращается в трехвалентное- гидроксид железа.  Именно он делает воду «ржавой», появляется в виде коричнево- ржавого налета на стенках ванн и душевых кабин после мытья. Средний показатель растворенного железа в городе Тверь: 1-4 мг/литр (при норме 0,3 мг/л).

 Симптомом наличия солей жесткости в воде может служить белый налет в чайнике, и чем быстрее налет нарастает, тем больше его в воде. Показатели  в Твери почти  в пределе допустимого  – 7 мг-экв/литр (при норме 7 мг-экв/литр). 

 

 Внешний вид- классическое расположение колб с фильтрами. Все выполнено из приятного на ощупь и качественного пластика. Комплект состоит из корпуса фильтра с установленными картриджами, ключами для съема, подробной инструкцией, краником питьевой воды, и трубкой с краном для подключения к водопроводу. Все упаковано и готово к подключению.

 

Фильтр оборудован картриджами:

  1. Механическая очистка. Именно он удаляет нерастворимые частицы, такие как песок, ржавчина и всякую взвесь. Маркировка картриджа PP, 10″SLIM. Размер удаляемых частиц- до 5 мкм.
  2. Комплексная очистка и умягчение воды. Картридж с названием «Арагон 2». Основное назначение- убрать из воды соли жесткости, сделать воду более мягкой. Работает по принципу ионного обмена, можно регенерировать в домашних условиях. Помимо солей, убирает хлор, бактерии, тяжелые металлы, пестициды. Разработчик путем введения в структуру гранул ионообменной смолы специального полимера, увеличил емкость материала по удалению солей жесткости в 5 раз.
  3. Кондиционирование воды. Универсальный сорбционный картридж (БАФ), снижает содержание железа и тяжелых металлов. Ресурс до 10000 литров

 Крепление фильтра к стене. Дюбеля и шурупы в комплекте не идут.

 Удобное и быстрое соединение. Вынимаем красную заглушку и вставляем трубку. Ничего затягивать не нужно.

 Интересно сделана система переключения направления воды. Допустим, если вас не устраивает направление подключения картриджей 1-2-3, то повернув специальную вставку на 180 градусов (фото снизу), можно сделать последовательность очистки по схеме 3-2-1.

 Колба выполнена из толстого пластика, и укомплектована двумя резиновыми уплотняющими кольцами. Самостоятельная  замена картриджей сложностей вызвать не должна. Для откручивания колб в комплекте предусмотрен специальный ключ.

 

 Инструкция подробно описывает характеристики и способы подключения фильтра. Для самостоятельного подключения потребуется отключить холодную воду и найти место присоединения вентиля с выходом для подключение фильтра.

 Инструкция одновременно служит и гарантийным талоном. На последней странице требуйте заполнения формы и печать продающей организации.

 Картридж, который отвечает за удаление солей жесткости, способен к регенерации. Это значит, что фильтр через некоторое время перестанет эффективно выполнять свои функции, и чтобы не покупать новый картридж, достаточно поместить его в раствор реагента и тем самым восстановить работоспособность картриджа. В инструкции способ восстановления подробно описан. В качестве реагента выступают вещества, которые доступны всем, и есть практически на каждой кухне.

  Вот такой ключ идет в комплекте, который поможет снять заглушку с картриджа.

Питьевой краник выполнен из нержавеющей стали и снабжен силиконовыми уплотнительными кольцами.

 А вот этот кран «врезается» в водопроводную систему и с помощью пластиковой трубки подключается к фильтру.

 

Фильтр изготовлен под торговой маркой «Гейзер» в России. Рейтинг фильтра среди пользователей интернета 4-5 звезд по пятибалльной системе.

Приобрести можно в нашем магазине вот по этой ссылке.

К сведению.

Хочется отметить, что данный тип фильтра предназначен для получения питьевой воды. Пользоваться им в других целях- значит резко снижать ресурс картриджей. По отзывам пользователей, в фильтре все-таки требуется достаточно часто менять картриджи, особенно в районах с грязной водой, и редко у кого, после четырех месяцев использования, накипь в чайнике не появляется. Заявленный ресурс использования в 10000 литров (почти 10 тонн воды) на наш взгляд- утверждение больше рекламное, хотя, если вода на  входе фильтра идеально чистая, вполне возможно, что ресурс в 10000 литров цифра достижимая. 

Гейзер 1УЖ Евро отзывы покупателей и специалистов на отзовик

В целом покупка оправдана. Но больше подойдёт для людей спокойных, экономных и с руками из нужного места.
Я с успехом использую фильтр «Гейзер-1УЖ» в старом корпусе уже 16 лет, за это время поменял 2 картриджа, хотя острой необходимости в этом не было.
http://img-fotki.yandex.ru/get/233608/78894615.3b/0_149e68_781b84a9_orig

Отдельный комментарий про разность типов картриджей, это важно:

1. Один тип: Арагон, Арагон-М, Арагон-Ж, Арагон-ЕМ, Арагон-ЕЖ — состоит исключительно из композитного материала Арагон.
Возможна регенерация: а) солью, б) лимонной кислотой+содой, в) кипячением с применением лимонной кислоты+соды.

2. Второй тип: Арагон 2 — композитный материал на основе материала Арагон Ж и ионообменной смолы.
Допустима исключительно холодная регенерация: б) лимонной кислотой+содой. От соли и кипячения Арагон-2 механически разрушается.

Ещё раз:
«Солью можно регенерировать ПО ОТДЕЛЬНОСТИ и картридж Арагон, и ионообменную смолу, но для сочетания материалов (как, например, в Арагоне-2) данный метод регенерации не подходит из-за отличия характеристик материалов. Поэтому, картридж АРАГОН-2 регенерировать солью НЕЛЬЗЯ!

Несмотря на то, что оба материала, составляющие вкупе Арагон-2, по отдельности с успехом могут регенерироваться насыщенным раствором соли, в комбинации друг с другом они не являются устойчивым соединением при воздействии на них соленой средой. Ионообменная смола в соленом растворе разбухает и разрывает соединения глобул материала Арагон.

Поэтому, для модификации картриджа Арагон-2 , компания-разработчик, настоятельно рекомендует использовать для очистки от растворенного железа и солей жесткости метод с использованием раствора лимонной кислоты и соды».

1. Ресурс, в частности главного фильтрпатрона — 25 тонн с регенерацией, это при 5 литрах в день — 13 лет,2. Очень низкая стоимость очищенной воды относительно стоимости фильтра и расходников — угля, лимонной кислоты, соды, соли,3. Возможность самостоятельной засыпки во внутренний разборный патрон отдельно купленного активированного угля,4. Поддержка производителем типов картриджей к моделям, выпущенным 20 лет назад,5. Компактность,6. Производительность.

Регенерация (восстановление свойств) умягчающего ионообменного картриджа | Статьи

В бытовых подмоечных фильтрах для умягчения воды, чаще всего используются специальные картриджи с ионообменной смолой. В основе их работы лежит ионообменный процесс, при котором растворенные в воде ионы кальция и магния заменяются на безвредные ионы натрия.

Такой метод является наиболее эффективным способом удаления из воды избыточного содержания солей жесткости. Однако ресурс таких картриджей, как правило, относительно небольшой. Способность такого картриджа смягчать воду напрямую зависит от объема засыпанной в него ионообменной смолы и степени жесткости вашей водопроводной воды.

Зачастую умягчающий картридж исчерпывает свой ресурс раньше остальных картриджей в системе фильтрации. Появление накипи на нагревательных элементах Вашего чайника или другого прибора означает, что умягчающий картридж исчерпал свой ресурс и подлежит замене или регенерации.

Для снижения эксплуатационных затрат, некоторые производители фильтров для воды предусматривают разборную конструкцию специальных умягчающих картриджей. Это дает возможность самостоятельно, в бытовых условиях, проводить многократную регенерацию (восстановление) ионообменных свойств наполнителя таких картриджей.

Процедура регенерации проста и не требует специальных навыков.

1. Перекройте подачу воды на фильтр.

2. Раскрутите ту колбу фильтра, в которой установлен умягчающий картридж.

3. Разберите картридж с ионообменной смолой согласно инструкции к Вашему фильтру.

4. Подготовьте раствор обычной поваренной соли в пропорции 300 грамм соли на 1 литр воды.

5. Высыпьте с картриджа ионообменную смолу в полученный раствор соли.

6. Выдержите ионообменную смолу в растворе соли на протяжении 5-6 часов, периодически помешивая ее.

7. Слейте раствор соли с емкости и промойте ионообменную смолу 2-3 раза холодной водой.

8. Поставьте пустой картридж в мойку и вылейте в него воду с промытой ионообменной смолой.

9. Соберите умягчающий картридж в порядке обратном разборке и вставьте его в колбу фильтра.Поставьте колбу на свое место в системе фильтра и откройте подачу воды на него.

10. Слейте первые 10-15 литров воды.

Арагон 2 регенерация инструкция — Строительный портал №1

<< фильтры для воды >><< картриджи >> << картриджи Гейзер >><< Регенерация Арагон Статья
 
 
      
  

 Механическая очистка. Замена дозатора.  
 
Раскрутить входящим в комплект поставки ключом второй корпус, и вывернуть картридж Арагон.
Вылить из него воду (у Арагон-М специальным ключом вывернуть донную заглушку, извлечь при необходимости дозатор, ввернуть заглушку до упора) и очистить внешнюю поверхность картриджа мягкой щеткой (например платяной) под струей воды. При замене картриджа Арагон достать из использованного картриджа вставку В и переставить в новый картридж, снять крышку нового дозатора, вставить его открытой стороной вверх и ввернуть донную заглушку до упора.
Собрать фильтр в обратном порядке и промыть его 1-2 минуты.

   
 

 
* У Арагон-М специальным ключом вывернуть донную заглушку, извлечь и заменить при необходимости дозатор, ввернуть заглушку до упора

 

Очистка от солей жесткости

 Регенерация  (проводится после механической очистки)
 
Приготовить раствор для регенерации. В емкость 1,5-2 л насыпать 40 г лимонной кислоты, 30 г (2 столовые ложки) соды и залить 1л воды. Заливать воду следует в несколько приемов, поскольку при этом происходит вспенивание (выделение углекислого газа).
Установить картридж в корпус и полностью залить его приготовленным раствором (примерно 0,6 л).
Оставить на 10-12 часов, после чего вынуть картридж и вылить отработанный раствор.
Поставить картридж вертикально в мойку и пролить через него оставшийся раствор, заливая внутрь через резьбовую горловину и дать полностью стечь.
Вымыть водой остатки раствора из картриджа в два этапа. Сначала 3 литра воды залить порциями до самого верха картриджа через резьбовую горловину. Затем обернуть горловину полиэтиленовой пленкой и закрепить её резинкой или бечевкой.
Перевернуть и выкрутить соответствующим ключом донную заглушку.
Поставить в мойку в этом положении вертикально и пролить ещё 3 литра воды, как описано выше.
Снять пленку и ввернуть на место донную заглушку.
Собрать фильтр в обратном порядке.
Открыть кран для чистой воды и промыть фильтр водой со скоростью 1-1,5 л/мин в течение 3 мин.

 

       

* Перед сборкой смажьте уплотнительное кольцо (рис. 2 поз. 6) вазелином или силиконовой смазкой (не путать с герметиком!).
 
Очистка от солей железа

Регенерация (проводится после механической очистки)
 
В эмалированной или стеклянной посуде приготовить 3 литра горячего 3% раствора лимонной кислоты (40 г. или 2 столовые ложки на литр воды)

 

Поставить картридж в мойку или соответствующую емкость на подставку и проливать через него приготовленный раствор, заливая его внутрь картриджа Арагон через резьбовую горловину порциями до самого верха до тех пор, пока выходящий из него раствор не станет чистым и прозрачным.
Приготовить 0.6л 2% раствора питьевой соды (1 чайная ложка соды на 0.6 л).
Установить картридж Арагон в корпус и залить внутрь раствор соды. Заливать раствор нужно через горловину картриджа, до тех пор, пока он весь и корпус не заполнятся раствором.
Через час вылить раствор и собрать фильтр в обратном порядке.* Открыть кран чистой воды и пролить воду в течение 5 минут.
Фильтр готов к работе.

Source: yvk.com.ua

Текущие концепции и будущие направления

45. МакГонагл Д., английский А, Джонс Э.А.: Актуальность мезенхимальных стволовых клеток

in vivo для будущих ортопедических стратегий, направленных на восстановление переломов.

Curr Orthop 2007, 21 (4): 262-267.

46. Wakitani S, Okabe T, Horibe S, Mitsuoka T, Saito M, Koyama T, Nawata M,

Tensho K, Kato H, Uematsu K, Kuroda R, Kurosaka M, Yoshiya S, Hattori K,

Огуши Х: Безопасность аутологичной мезенхимальной трансплантации костного мозга

Трансплантация стволовых клеток для восстановления хряща у 41 пациента с 45 суставами

под наблюдением до 11 лет и 5 месяцев.J Tissue Eng Regen Med 2011,

5 (2): 146-150.

47. Мацумото Т., Кавамото А., Курода Р., Исикава М., Мифунэ Ю., Ивасаки Х,

Мива М., Хории М., Хаяси С., Оямада А., Нишимура Х, Мурасава С., Дойта М.,

Куросака М., Асахара Т. Терапевтический потенциал васкулогенеза и

остеогенеза, стимулируемого CD34-положительными клетками периферической крови, для функционального заживления

костей. Am J Pathol 2006, 169: 1440-1457.

48. Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P,

Lorenz HP, Hedrick MH: Многолинейные клетки из жировой ткани человека:

последствия для клеточной терапии.Tissue Eng 2001, 7 (2): 211-228.

49. Джексон В.М., Арагон А.Б., Джуад Ф., Сонг Й., Келер С.М., Нести Л.Дж., Туан Р.С.:

Мезенхимальные клетки-предшественники, полученные из травмированных мышц человека.

J Tissue Eng Regen Med 2009, 3 (2): 129-138.

50. Im GI, Shin YW, Lee KB: Обладают ли мезенхимальные стволовые клетки

, полученные из жировой ткани, таким же остеогенным и хондрогенным потенциалом, как и клетки костного мозга

, полученные из костного мозга? Остеоартрозный хрящ 2005, 13 (10): 845-853.

51. Niemeyer P, Fechner K, Milz S, Richter W, Suedkamp NP, Mehlhorn AT,

Pearce S, Kasten P: Сравнение мезенхимальных стволовых клеток из кости

костного мозга и жировой ткани для регенерации кости в критическом размере

Дефект голени барана и влияние богатой тромбоцитами плазмы.

Биоматериалы 2010, 31 (13): 3572-3529.

52. Джонс Э., МакГонагл Д: Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека в

vivo. Ревматология (Оксфорд) 2008, 47 (2): 126-131.

53. Джонс Е.А., Кинси С.Е., Инглиш А., Джонс Р.А., Страшински Л., Мередит Д.М.,

Маркхэм А.Ф., Джек А., Эмери П., МакГонагл Д.: Выделение и характеристика

мультипотенциальных мезенхимальных клеток-предшественников костного мозга. Артрит

Реум 2002, 46 (12): 3349-3360.

54. Джонс Э., Инглиш А, Черчман С.М., Курупис Д., Боксалл С.А., Кинси С.,

Джаннудис П.Г., Эмери П., МакГонагл Д.: крупномасштабная экстракция и

характеризация мультипотенциальных стромальных клеток CD271 + из трабекулярных

кость в здоровье и остеоартрит: значение для регенерации кости

стратегии, основанные на некультивируемых или минимально культивируемых мультипотенциальных

стромальных клетках.Arthritis Rheum 2010, 62 (7): 1944-1954.

55. Akkouch A, Zhang Z, Rouabhia M: новый коллаген / гидроксиапатит / поли

(лактид-ε-капролактон) биоразлагаемый и биоактивный трехмерный пористый каркас

для регенерации кости. J Biomed Mater Res A 2011, 96A: 693-704.

56. Tampieri A, Landi E, Valentini F, Sandri M, D’Alessandro T, Dediu V,

Marcacci M: концептуально новый тип биогибридного каркаса для регенерации кости

. Нанотехнологии 2011, 22 (1): 015104.

57. Laschke MW, Witt K, Pohlemann T, Menger MD: Нанокристаллическая паста для инъекций

гидроксиапатита для замещения кости: анализ in vivo биосовместимости и васкуляризации

. J Biomed Mater Res B Appl Biomater

2007, 82 (2): 494-505.

58.

Сальгадо А.Дж., Коутиньо О.П., Рейс Р.Л.: Инженерия костной ткани: состояние

и будущие тенденции. Macromol Biosci 2004, 4 (8): 743-765.

59. Роуз FR, Oreffo RO: Инженерия костной ткани: надежда против шумихи.Biochem

Biophys Res Commun 2002, 292: 1-7.

60. Джонс EA, Ян XB: Мезенхимальные стволовые клетки и их будущее в костях

Ремонт. Int J Adv Rheumatol 2005, 3 (3): 15-21.

61. Chatterjea A, Meijer G, van Blitterswijk C, de Boer J: Клиническое применение

человеческих мезенхимальных стромальных клеток для инженерии костной ткани. Ствол

Cells Int 2010, 2010: 215625.

62. Kim SJ, Shin YW, Yang KH, Kim SB, Yoo MJ, Han SK, Im SA, Won YD,

Sung YB, Jeon TS, Chang CH, Jang JD, Lee SB, Kim HC, Lee SY : Многоцентровое рандомизированное клиническое исследование

для сравнения эффективности и безопасности инъекции аутологичного культивированного остеобласта

(Ossron) для лечения переломов.BMC

Musculoskelet Disord 2009, 10:20.

63. Огуши Х., Котобуки Н., Фунаока Х., Мачида Х., Хиросе М., Танака Й.,

Такакура Y: тканевый керамический искусственный сустав — остеогенный ex vivo

дифференцировка мезенхимальных клеток пациента на всех голеностопных суставах для

лечение остеоартроза. Биоматериалы 2005, 26 (22): 4654-4661.

64. Kokemueller H, Spalthoff S, Nolff M, Tavassol F, Essig H, Stuehmer C,

Bormann KH, Rücker M, Gellrich NC: Изготовление васкуляризированных

биоискусственных костных трансплантатов in vivo для сегментарной реконструкции

9000 нижней челюсти. экспериментальное пилотное исследование на овцах и первое клиническое применение.Int J Oral

Maxillofac Surg 2010, 39 (4): 379-387.

65. Tarte K, Gaillard J, Lataillade JJ, Fouillard L, Becker M, Mossafa H, Tchirkov A,

Rouard H, Henry C, Splingard M, Dulong J, Monnier D, Gourmelon P,

Gorin NC, Sensebé L, Société Française de Greffe de Moelle et Thérapie

Cellulaire: Производство мезенхимальных стромальных клеток человека

клинического уровня: возникновение анеуплоидии без трансформации. Кровь 2010,

115 (8): 1549-1553.

66. Weinand C, Xu JW, Peretti GM, Bonassar LJ, Gill TJ: Условия, влияющие на посев клеток

на трехмерные каркасы для клеточных биоразлагаемых имплантатов

. J Biomed Mater Res B Appl Biomater 2009,

91 (1): 80-87.

67. Yoshioka T, Mishima H, Ohyabu Y, Sakai S, Akaogi H, Ishii T, Kojima H,

Tanaka J, Ochiai N, Uemura T: Ремонт больших костно-хрящевых дефектов с помощью

аллогенных хрящевых агрегатов, образованных из костных агрегатов

клеток костного мозга с использованием биореактора RWV.Журнал Ортоп Рес 2007, 25 (10): 1291-1298.

68. Каплан А.И.: Мезенхимальные стволовые клетки и генная терапия. Clin Orthop Relat

Res 2000, 379 (Suppl): S67-70.

69. Chen Y: Ортопедическое применение генной терапии. J Orthop Sci 2001,

6: 199-207.

70. Калори Г.М., Донати Д., Ди Белла С., Тальябу Л.: Костные морфогенетические белки

и тканевая инженерия: направления будущего.

Травма 2009, 40 (Дополнение

3): S67-76.

71. Тан И, Тан В., Линь И, Лонг Дж, Ван Х, Лю Л., Тиан В. Комбинация инженерии костной ткани

и трансфекции гена BMP-2 способствует заживлению кости

у крыс с остеопорозом.Cell Biol Int 2008, 32 (9): 1150-1157.

72. Лакруа Д., Прендергаст П.Дж .: Модель механо-регуляции дифференцировки тканей

во время заживления перелома: анализ размера зазора и нагрузки.

Дж. Биомех 2002, 35 (9): 1163-1171.

73. Перрен С.М.: Физические и биологические аспекты заживления переломов с особым упором на внутреннюю фиксацию

. Clin Orthop Relat Res 1979,

138: 175-196.

74. Ягодзински М., Креттек С: Влияние механической стабильности на перелом

заживление — обновление.Травма 2007, 38 (Дополнение 1): S3-10.

75. Эпари Д. Р., Шелл Х., Бейл Х. Дж., Дуда Г. Н.: Нестабильность продлевает хондральную фазу

во время заживления костей у овец. Кость 2006, 38 (6): 864-870.

76. Schell H, Epari DR, Kassi JP, Bragulla H, Bail HJ, Duda GN: На курс заживления кости

влияет исходная стабильность фиксации при сдвиге. J Orthop

Res 2005, 23 (5): 1022-1028.

77. Claes L, Eckert-Hübner K, Augat P: Влияние механической стабильности на локальную васкуляризацию

и дифференциацию тканей при заживлении костной мозоли.J Orthop

Res 2002, 20 (5): 1099-1105.

78. Lienau J, Schell H, Duda GN, Seebeck P, Muchow S, Bail HJ: Начальная

Васкуляризация

и дифференцировка тканей зависят от стабильности фиксации

. J Orthop Res 2005, 23 (3): 639-645.

79. Babis GC, Soucacos PN: Костные каркасы: роль механической стабильности

и инструменты. Травма 2005, 36 (Дополнение): S38-S44.

80. Тран Г.Т., Пагкалос Дж., Циридис Э., Нарвани А.А., Гелиотис М., Манталарис А., Циридис Э .:

Гормон роста: играет ли он терапевтическую роль в заживлении переломов?

Заключение экспертов по исследованию наркотиков 2009, 18 (7): 887-911.

81. Рубин М.Р., Билезикян Дж. П.: Паратиреоидный гормон как анаболическая скелетная терапия.

. Наркотики 2005, 65 (17): 2481-2498.

82. Tzioupis CC, Giannoudis PV: Безопасность и эффективность паратироидного гормона

(ПТГ) в качестве модификатора биологической реакции для улучшения

регенерации кости. Curr Drug Saf 2006, 1 (2): 189-203.

83. Verhaar HJ, Lems WF: аналоги ПТГ и остеопоротические переломы. Эксперт

Opin Biol Ther 2010, 10 (9): 1387-1394.

84. Kanis JA, Burlet N, Cooper C, Delmas PD, Reginster JY, Borgstrom F,

Rizzoli R: Европейское общество клинических и экономических аспектов

Остеопороз и остеоартрит (ESCEO): Европейское руководство для

диагностика

и лечение остеопороза у женщин в постменопаузе.

Osteoporos Int 2008, 19 (4): 399-428.

85. Charopoulos I, Orme S, Giannoudis PV: Роль и эффективность деносумаба

в лечении остеопороза: обновленная информация.Мнение эксперта

Drug Saf 2011.

86. Чен Ю., Алман Б.А.: Путь Wnt, важная роль в регенерации костей.

J Cell Biochem 2009, 106 (3): 353-362.

87. Wagner ER, Zhu G, Zhang BQ, Luo Q, Shi Q, Huang E, Gao Y, Gao JL,

Kim SH, Rastegar F, Yang K, He BC, Chen L, Zuo GW, Bi Y , Su Y, Luo J,

Luo X, Huang J, Deng ZL, Reid RR, Luu HH, Haydon RC, He TC:

терапевтический потенциал пути передачи сигналов Wnt при заболеваниях костей.

Curr Mol Pharmacol 2011, 4 (1): 14-25.

Dimitriou et al. BMC Medicine 2011, 9:66

http://www.biomedcentral.com/1741-7015/9/66

Страница 9 из 10

YAP опосредует регенерацию волосковых клеток в органах баланса цыплят, но киназы LATS подавляют его Активность у мышей

Abstract

Потеря сенсорных волосковых клеток вызывает постоянные нарушения слуха и равновесия у людей и других млекопитающих, но для немлекопитающих такие нарушения являются временными. Немлекопитающие восстанавливают слух и чувствительность равновесия после того, как поддерживающие клетки пролиферируют и дифференцируются в замещающие волосковые клетки.Свидетельства механических различий между этими сенсорными эпителиями и поддерживающими их клетками побудили нас исследовать, коррелирует ли способность активировать YAP, эффектор в механочувствительном пути бегемота, с регенеративной способностью в чувствительных к ускорению маточках кур и мышей обоих полов. После удаления волосковых клеток YAP накапливался в ядрах поддерживающих клеток в куриных маточках и способствовал регенеративной пролиферации, но YAP оставался цитоплазматическим, и в маточках мышей наблюдалась небольшая пролиферация.Локализация YAP в поддерживающих клетках также была более чувствительной к изменению формы и ингибированию MST1 / 2 в маточках цыпленка, чем в маточках мыши. Генетические манипуляции показали, что экспрессия in vivo варианта YAP-S127A вызвала сильную пролиферацию поддерживающих клеток новорожденных мышей, которые продуцировали потомство, которое экспрессировало маркеры волосковых клеток, но пролиферативные ответы снижались постнатально. Экспрессия YAP-5SA, который более эффективно избегает ингибирующего фосфорилирования, приводит к TEAD-зависимой пролиферации стриолярных поддерживающих клеток даже в маточках взрослых.Условная делеция киназ LATS1 / 2 отменяла ингибирующее фосфорилирование эндогенного YAP и приводила к пролиферации стриол в маточках взрослых мышей. Полученные данные свидетельствуют о том, что повреждение преодолевает ингибирующую передачу сигналов Hippo и способствует регенеративной пролиферации в маточках немлекопитающих, тогда как конститутивная активность киназы LATS1 / 2 подавляет передачу сигналов YAP-TEAD в маточках млекопитающих и способствует поддержанию пролиферативного покоя, который, по-видимому, лежит в основе постоянства сенсорных дефицитов.

ЗАЯВЛЕНИЕ О ЗНАЧЕНИИ Громкие звуки, ототоксические препараты, инфекции и старение убивают чувствительные волосковые клетки в ухе, вызывая необратимую потерю слуха и нарушение равновесия у миллионов людей. У немлекопитающих повреждение вызывает изменения формы поддерживающих клеток, которые могут делиться и восстанавливать волосковые клетки. Такие изменения формы ограничены в ушах млекопитающих, где поддерживающие клетки развивают богатые E-cadherin апикальные соединения, усиленные прочными полосами F-actin, и клетки не в состоянии делиться. Здесь мы обнаружили, что повреждение легко активирует YAP в поддерживающих клетках в эпителии баланса кур, но не мышей.Удаление киназ LATS или экспрессия вариантов YAP, которые избегают LATS-опосредованного ингибирующего фосфорилирования, индуцируют пролиферацию в поддерживающих клетках взрослых мышей. Передача сигналов YAP в конечном итоге может быть использована для преодоления пролиферативного покоя, который ограничивает регенерацию в ушах млекопитающих.

Ключевые слова: волосковая клетка, бегемот, LATS, регенерация, утрикл, YAP

Введение

От потери слуха страдают более 400 миллионов человек во всем мире, а нарушения баланса — еще миллионы (Agrawal et al., 2009; Всемирная организация здравоохранения, 2018 г.). Потеря сенсорных волосковых клеток (HCs) во внутреннем ухе является основной и постоянной причиной этих нарушений, потому что потерянные HC не эффективно восполняются у людей и других млекопитающих (Forge et al., 1993; Nadol, 1993; Warchol et al. , 1993; Голуб и др., 2012; Мизутари и др., 2013). Напротив, птицы, рыбы и земноводные эффективно заменяют УВ после повреждения и восстанавливают сенсорную функцию (Corwin, Cotanche, 1988; Ryals, Rubel, 1988; Jones, Corwin, 1996; Smolders, 1999; Harris et al., 2003; Смит и др., 2006; Lush, Piotrowski, 2014). У этих немлекопитающих соседние поддерживающие клетки (SCs) либо генерируют потомство, которое заменяет HCs, либо конвертируются непосредственно в HCs (Balak et al., 1990; Adler and Raphael, 1996; Baird et al., 1996). Однако способность SCs млекопитающих делиться и замещать HCs резко снижается после рождения по причинам, которые пока неясны (Burns et al., 2012a; Cox et al., 2014). Усилия по усилению регенеративного ответа SCs млекопитающих включали лечение факторами роста, ингибирование передачи сигналов Notch и стимуляцию канонической передачи сигналов Wnt (Gu et al., 2007; Wang et al., 2015a; You et al., 2018). Эти манипуляции перспективны для новорожденных мышей, но их эффективность снижается по мере взросления млекопитающих и перехода SC в более устойчивое состояние покоя (Gu et al., 2007; Collado et al., 2011b; Maass et al., 2015; Atkinson et al. ., 2018; Samarajeewa et al., 2018). Остается необходимость понять механизмы, которые поддерживают SCs млекопитающих в этом состоянии покоя.

Возможное объяснение возникло в результате исследований матки, одного из видов органа равновесия.В культивируемых листах утрикулярного эпителия SCs от незрелых мышей быстро распространяются и размножаются, но способность распространяться и размножаться резко снижается с возрастом (Davies et al., 2007; Meyers and Corwin, 2007; Lu and Corwin, 2008). В то же время SCs млекопитающих развивают усиленные апикальные соединения с высоким уровнем E-кадгерина и исключительно толстыми кольцевыми полосами F-актина (Burns et al., 2008, 2013; Collado et al., 2011b; Luo et al., 2018) . Напротив, SC от кур экспрессируют мало E-кадгерина, имеют тонкие полосы F-актина на своих апикальных соединениях и свободно распространяются и размножаются на протяжении всей жизни (Burns et al., 2008, 2013). Выводы привели нас к исследованию пути Hippo и его эффектора, Yes-ассоциированного белка (YAP), который объединяет механические и биохимические факторы для контроля над пролиферацией (Irvine and Shraiman, 2017; Totaro et al., 2018).

В каноническом пути Hippo киназный каскад MST1 / 2 и LATS1 / 2 фосфорилирует YAP, что приводит к его цитоплазматической секвестрации и деградации (Dong et al., 2007; Zhao et al., 2007, 2010). В отсутствие такой ингибирующей передачи сигналов YAP может накапливаться в ядрах, где он способствует пролиферации с помощью факторов транскрипции TEAD (Vassilev et al., 2001; Чжао и др., 2007). Транскрипционная активность YAP-TEAD снижается в ответ на увеличение плотности клеток во время утрикулярного развития, что способствует начальной остановке роста (Gnedeva et al., 2017), но роль MST1 / 2 и LATS1 / 2 во внутреннем ухе не имеет значения. еще не изучен. Мы предположили, что повреждение легко реактивирует передачу сигналов YAP-TEAD в SCs в регенеративных ушах немлекопитающих, но не в ушах млекопитающих.

Здесь мы сообщаем, что в куриной матке MST1 / 2-зависимая передача сигналов Hippo секвестрировала YAP в цитоплазме SC, и что потеря HC заставляла YAP накапливаться в ядрах и способствовать регенеративной пролиферации.В SC мышиного маточного пузыря YAP оставался цитоплазматическим после потери HC. Там пролиферативное молчание было преодолено экспрессией нечувствительных к фосфорилированию вариантов YAP или условной делецией LATS1 / 2, даже в маточках от взрослых мышей. Полученные данные обеспечивают новую механистическую основу для объяснения различий в регенеративной замене HCs между млекопитающими и немлекопитающими и впервые демонстрируют, что передача сигналов YAP-TEAD может использоваться для содействия пролиферации SCs во внутреннем ухе млекопитающих.

Результаты

Потеря HC приводит к ядерному накоплению YAP в SC курицы, но не в клетках мышей

Поскольку клетки регулируют активность YAP частично, контролируя его ядерный доступ (Shreberk-Shaked and Oren, 2019), мы проверили, может ли потеря HC вызвать ядерное накопление YAP в SC, которые необходимы для регенерации HC у посленкушенных цыплят. Мочеиспускания культивировали с 1 мМ стрептомицином в течение 24 часов для уничтожения HCs и фиксировали через 2 дополнительных дня в среде без стрептомицина.Затем для конфокальных изображений ядерного слоя SC вычисляли отношения N: C иммуноокрашивания YAP. Обработка стрептомицином снижала плотность УВ до 11% от уровня в необработанных контрольных культурах ( p <0,0001, t (10) = 16,77, n = 6 пузырьков на состояние; A , C , I ), что приводит к увеличению отношения N: C YAP на 22% ( p <0,0001, t (10) = 8,248, n = 6 бутылок на условие; B , D , J ).

YAP накапливается в ядрах SC после потери HC и опосредует регенеративную пролиферацию в маточках кур, но не мышей. A-H , Матки от цыплят P2 и мышей P1 культивировали в течение 24 часов со стрептомицином или без него и фиксировали через 72 часа для оценки потери HC на конфокальных изображениях апикальной поверхности и соотношений YAP N: C в SC ядерном слое. Стрептомицин индуцировал потерю HC у обоих видов, но YAP накапливался в ядрах SC только в поврежденных куриных маточках ( D ).Изображалась центральная (предполагаемая стриолярная) область матки мыши ( E – H ). I , Количественная оценка выявляет значительную потерю HC в обработанных стрептомицином маточках цыплят ( p <0,0001, n = 6 маточников) и мышей (всего: p = 0,0004, n = 8). Региональные сравнения матки мыши были выполнены с помощью теста Сидака (Lat: p = 0,48; Cen: p = 0,0065, Med: p <0.0001, n = 6-8). J , Количественная оценка соотношений N: C YAP выявляет значительное увеличение количества куриных маток, обработанных стрептомицином ( p <0,0001, n = 6). Повреждение не повлияло на матриксы мыши (всего: p = 0,98, n = 8). Региональные сравнения для матки мыши были выполнены с помощью теста Сидака (Lat: p = 0,99; Cen: p = 0,87, Med: p = 0,996, n = 8). K , L , Конфокальное изображение обработанных стрептомицином куриных маток P2.Те, которые культивировались с ДМСО ( K ), содержали значительно больше клеток EdU + и Myo7a + EdU + клеток (стрелка), чем те, которые культивировались с 1 мкМ CA3 ( L ) в течение дня 7. M , Количественное определение ячеек EdU + через 3 дня (пурпурные столбцы, левая ось y ) и Myo7a + EdU + ячеек через 7 дней (зеленые столбцы, правая ось и ) в пределах П2 куриные мешочки.Мочалки, обработанные стрептомицином, содержали значительно больше клеток EdU + , чем неповрежденные матки ( p <0,0001, тест t ). Обработанные стрептомицином мешочки, культивированные с ингибитором YAP-TEAD CA3, содержали меньше клеток EdU + дозозависимым образом ( p = 0,001, ANOVA с тестом множественных сравнений Даннета, n = 6–16). Обработка CA3 значительно снижала митотическую продукцию HC ( p = 0,034, n = 4). N , Мышиные пузыри P1 культивировали с 1 мМ стрептомицином или без него в течение 24 часов, а затем инкубировали 72 часа в присутствии EdU. Повреждение существенно не повлияло на плотность клеток Sox2 + EdU + ( p = 0,73, n = 9). Данные являются средними ± стандартное отклонение. нс p > 0,05, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001.

Мы использовали тот же протокол, чтобы определить, будет ли потеря HC вызывать ядерную транслокацию YAP в SC постнатального дня 1 (P1) матки мышей.Здесь обработка стрептомицином снизила плотность HC до 55% от уровня в неповрежденных контрольных культурах ( p = 0,0004, t (14) = 4,583, n = 8 пузырьков на состояние; E , G , I ), но мы не наблюдали разницы в соотношении N: C YAP (0,89 ± 0,10 против 0,89 ± 0,11, p = 0,9818, t (14) = 0,02327, n = 8 контейнеров; F , H , J ).

Чтобы проверить, опосредуют ли YAP и TEAD регенеративную пролиферацию в куриных маточках, мы культивировали матки со стрептомицином или без него в течение 24 часов для уничтожения HCs. Затем матриксы культивировали еще 2 дня в различных концентрациях CA3, низкомолекулярного ингибитора транскрипционной активности YAP-TEAD (Song et al., 2018). EdU добавляли за 24 ч до фиксации, чтобы пометить клетки, которые вошли в S-фазу. В обработанных стрептомицином маточках содержалось в 15 раз больше клеток EdU + , чем в неповрежденном контроле ( p <0.0001, t (20) = 5,48, n = 6-16 шт .; M ), и обработка CA3 вызвала дозозависимое снижение этой регенеративной пролиферации ( p = 0,0010, F (3,34) = 2,528, n = 7-16 бутылок, ANOVA; М ). Другие обработанные стрептомицином матки, которые культивировали с CA3 в течение 6 дней, содержали меньше клеток EdU + , которые экспрессировали HC-маркер Myo7a, чем соответствующие контроли ( p = 0.0337, t (6) = 2.741, n = 4 шт. К – М ). Напротив, абляция HC не вызвала значительной регенеративной пролиферации в матках мышей P1 в течение 3-дневного периода восстановления ( p = 0,73, t (16) = 0,35, n = 9 матриксов; N ) . В совокупности результаты предполагают, что потеря HC в маточках кур модулирует передачу сигналов, которая ведет к накоплению YAP в ядрах и регенеративной пролиферации SCs, но менее серьезная потеря HC в маточках мышей этого не делает.

Механические раны вызывают ядерное накопление YAP более эффективно в SCs цыплят, чем в клетках мышей

Поскольку стрептомицин убивал меньше HCs в маточках мыши, чем в UAP, мы не могли напрямую сравнивать ядерное накопление YAP в их SC после повреждения. . Чтобы обойти эту проблему и проверить, активизирует ли повреждение YAP в куриных SC больше, чем в мышиных SC, мы проанализировали их ответы на стандартизированное иссечение поражения. После 24 часов культивирования матки от постнатальных цыплят и мышей P1 поражали микропаншем диаметром 180 мкм и удаляли эпителий в области поражения (Meyers and Corwin, 2007; Collado et al., 2011а). После дополнительных 48 часов культивирования с EdU SC в месте поражения изменили форму и пролиферировали ( A , C , E , G ). Иммунореактивность YAP была увеличена в ядрах куриных SC на участке поражения ( B , D ). Транслокация была менее выражена в маточках мышей, при этом YAP равномерно распределялся между ядерным и цитоплазматическим компартментами SC в месте поражения ( F , H ).

В SCs, которые изменили форму до близких иссеченных повреждений, ядерное накопление YAP было более выраженным у кур, чем у мышей.После 24 часов культивирования в маточках от цыплят P2 и мышей P1 делали стандартизированные иссеченные очаги, которые культивировали еще 48 часов перед фиксацией. A-D , Повреждение вызвало очаговую пролиферативную реакцию в куриной матке ( A , C ). YAP заметно накапливается в ядрах SC, которые расширяются, чтобы закрыть поражение ( D ), по сравнению с плотно упакованными SC вне пораженной области ( B ). E-H , Повреждение также вызвало очаговую пролиферативную реакцию в матке мыши ( E , G ). Умеренное накопление YAP в ядрах было очевидно в СК, которые расширились, чтобы закрыть поражение в центре макулы ( H ) по сравнению с таковыми за пределами области поражения на периферии макулы ( F ). I , Регрессионный анализ выявил значительную связь между отношением N: C YAP и размером апикального домена SC в пораженной области куриной матки (наклон ненулевой при p <0.0001, n = 120 ячеек из 4 ячеек). Пунктирными линиями обозначен 95% доверительный интервал. J , Регрессионный анализ показывает умеренную связь между отношением N: C YAP и размером апикального домена SC в пораженной области матки мыши (наклон ненулевой при p = 0,0050, n = 120 клеток из 4 упаковки). K , Количественная оценка отношения YAP N: C в SC внутри пораженной области показала, что YAP был значительно обогащен ядрами SC матки курицы по сравнению с ядрами матки мыши, контролируя площадь апикального домена (каждый р <0.0001, двусторонний дисперсионный анализ с тестом Сидака, n = 19-58 клеток на ячейку на вид). L , Количественная оценка размера апикального домена SC за пределами пораженной области не выявила существенной разницы между матками курицы и мыши ( p = 0,6870, n = 4 матрикса). M , Количественная оценка отношения YAP N: C по конфокальным изображениям ядерного слоя SC в неповрежденной области не выявила значительных различий между куриными и мышиными матками ( p = 0.8852, n = 4–6 бутылок). Все графики отображают среднее значение ± стандартное отклонение. **** п <0,0001.

Изменение формы клетки (т.е. деформация) запускает ядерную транслокацию YAP в других типах клеток (Codelia et al., 2014; Benham-Pyle et al., 2015; Fletcher et al., 2018). Чтобы более тщательно изучить взаимосвязь между изменением формы и накоплением YAP в ядрах в SCs, мы измерили площадь апикального домена и соотношение N: C YAP для отдельных SC в центре каждого участка поражения. Регрессионный анализ показал, что в СК цыплят соотношение N: C YAP положительно коррелировало с площадью апикального домена ( r = 0.531, n = 120 ячеек, p <0,0001; I ). Обнаружилась значимая, но более слабая положительная корреляция между соотношением YAPN: C и площадью апикального домена SCs мыши в пределах участка поражения ( r = 0,255, n = 120 клеток, p = 0,005; J ). Куриные SC имели значительно более высокие отношения N: C YAP, чем мышиные SC, даже при контроле площади клеток ( p <0,0001, F (1,232) = 147, n = 240 клеток, двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA ; К ).За пределами очага поражения не было значительных различий в апикальной области ( p = 0,69, t (6) = 0,42, n = 4 матрикса; L ) или соотношении N: C YAP ( p = 0,89, t (8) = 0,15, n = 4-6 матриц; M ) между SC курицы и мыши. Результаты показывают, что ядерное накопление YAP в ответ на повреждение и, в частности, изменение формы ограничено в SCs мыши по сравнению с таковыми у кур.

Острое ингибирование активности киназы MST1 / 2 изменяет локализацию YAP в SC курицы, но не в клетках мышей

В каноническом пути Hippo каскад киназ MST1 / 2 и LATS1 / 2 фосфорилирует YAP, что приводит к его цитоплазматической секвестрации (Dong и др., 2007). Мы использовали XMU-MP-1, низкомолекулярный ингибитор активности киназы MST1 / 2 (Fan et al., 2016), чтобы проверить, регулирует ли этот канонический путь ядерный доступ YAP в маточках после вылупления цыплят и мышей P1. После 24-часового периода акклиматизации в стандартной среде мы обрабатывали культуры в течение 12 часов XMU-MP-1, носителем или блокатором ядерного экспорта лептомицином B в качестве положительного контроля (Dupont et al., 2011). Лептомицин B значительно увеличивал соотношение N: C YAP у обоих видов, указывая на то, что YAP динамически перемещается в ядра SC и из них в неповрежденных маточках цыплят и мышей (курица: p <0,0001, F (5, 20) = 37, n = 4 или 5, ANOVA; мышь: p <0,0001, F (2,14) = 56, ANOVA, n = 5 или 6; A– К ). В куриных маточках ингибирование MST1 / 2 привело к значительному увеличению отношения N: C YAP по сравнению с отрицательными контролями (1.14 ± 0,10 против 0,83 ± 0,07, p <0,0001, ANOVA с тестом Сидака; A , B ), который был обратимым после 24-часовой отмывки ( p <0,0001, ANOVA с тестом Сидака; E , J ). Мы не наблюдали увеличения отношения YAP N: C в матках мышей после 12-часовой инкубации с ингибитором MST1 / 2 (0,90 ± 0,11 против 0,90 ± 0,04, p = 0,9997, n = 6 пузырьков, ANOVA с тестом Даннета; G , H ), хотя 72-часовая инкубация значительно увеличила отношения N: C YAP у обоих видов по сравнению с контролем, обработанным ДМСО (курица: 1.04 ± 0,13 против 0,84 ± 0,03, p = 0,0008, t (14) = 4,23, n = 8 бутылок; мышь: 1,09 ± 0,17 против 0,88 ± 0,07, p = 0,0103, t (11) = 3,09, n = 6 или 7 матриц; L – P ). Результаты подтверждают, что каноническая передача сигналов Hippo необходима для цитоплазматической секвестрации YAP в SCs кур. Эта ингибирующая передача сигналов легко инактивировалась или игнорировалась при повреждении, что приводило к накоплению в ядре YAP ().В мышиных SC, однако, цитоплазматическая секвестрация YAP была менее чувствительна к повреждению или острому ингибированию MST1 / 2.

Острое ингибирование активности киназы MST1 / 2 индуцировало ядерное накопление YAP в SCs цыплят, но не в таковых у мышей. AI , Изображения с большим увеличением иммунореактивности YAP (псевдоцветные) в SC ядерном слое эксплантированных куриных маток P2 ( AF ) или маток мышей P1 ( GI ), культивированных в отрицательном контроле с носителем, Ингибитор киназы MST1 / 2 XMU-MP-1 (XMU) в концентрации 3 мкМ или лептомицин B (LMB) в концентрации 40 нг / мл в качестве положительного контроля.Через 12 ч интенсивность YAP выше в цитоплазме, чем в ядрах в контроле с носителем ( A , G ), и он обогащен ядрами в матрицах, обработанных LMB ( C , I ). Обработка XMU увеличивает ядерные уровни YAP до промежуточной степени в куриной матке ( B ) и является обратимой после 24-часовой промывки ( E ). XMU не влиял на соотношение YAP N: C в матке мыши в течение 12-часового импульса ( H ).Изображалась центральная (стриолярная) область матки мышей ( G – I ). J , Количественная оценка показывает, что 12-часовой импульс XMU значительно увеличивает отношение N: C YAP по сравнению с контрольными носителями в куриных маточках ( p <0,0001, n = 5 бутылочек, ANOVA с тестом Сидака). Вымывание XMU возвращает отношение N: C YAP к исходным уровням ( p <0,0001, n = 4 или 5). LMB значительно увеличивает соотношение N: C YAP ( p <0.0001, n = 4 или 5). K , Количественная оценка показывает, что 12-часовая обработка LMB значительно увеличила соотношение YAP N: C в маточках мыши по сравнению с носителем (ANOVA с тестом Даннета, p <0,0001, n = 5 или 6), но XMU не имел никакого эффекта (ANOVA с тестом Даннета, p = 0,99, n = 6). Для сравнений по регионам использовали дисперсионный анализ ANOVA с повторными измерениями с тестом Даннета. L – O , Конфокальные изображения иммунореактивности YAP из ядерного слоя SC в маточках от цыплят P2 ( L , M ) и мышей P1 ( N , O) ), которые культивировали в 3 мкМ XMU или ДМСО в течение 72 часов. P , Количественная оценка показывает, что 72-часовая обработка XMU значительно увеличила соотношение YAP N: C в куриных маточках ( p = 0,0008, n = 8) и мышиных маточках ( p = 0,0103, n. = 6 или 7) по сравнению с контролями, обработанными ДМСО. Данные являются средними ± стандартное отклонение. нс p > 0,05, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001.

YAP-S127A индуцирует транскрипционную активность YAP-TEAD и пролиферацию SC в маточках новорожденных мышей

Наши находки к этому моменту предполагают, что YAP ограничен цитоплазмой SCs мыши, несмотря на потерю HC и резкое ингибирование MST1 / 2.Мы предположили, что сверхэкспрессия YAP-S127A, который содержит активирующую мутацию серина 127, которая предотвращает связывание с белками 14-3-3 и удерживание в цитоплазме (Basu et al., 2003), может обходить эту регуляцию. Для этого мы скрестили мышей с индуцибельным аллелем Yap-S127A с мышами Sox10 rtTA / + для получения потомства, в котором трансген будет экспрессироваться в SC и других клетках Sox10 + только после введения доксициклин (Ludwig et al., 2004; Камарго и др., 2007; Уолтерс и Цзо, 2015). Мы ввели доксициклин внутрибрюшинно потомству P1 и дополнили питьевую воду матери. EdU вводили подкожно на P2, P3 и P4, и собирали маточные частицы на P5. В SC Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + мышей иммунореактивность YAP была заметно увеличена по сравнению с SC в матрицах от WT, Sox10 / rt , и Yap-S127A +/- однопометников ( A – D ).Более того, в маточках с детенышами Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + было обнаружено 35-кратное увеличение количества клеток EdU + по сравнению с контрольными однопометниками (97 ± 54 EdU + клеток / 10 000 мкм 2 , p <0,0001, F (3,27) = 20,8, n = 5-11 мышей, ANOVA; A – E ). Эти клетки EdU + экспрессировали SC-маркер Sox2 (D ′ ′ ′). EdU + SC располагались по всей матке, но были немного обогащены в латеральной области ( p = 0.0011, F (2.9,43.1) = 6,5, n = 16 бутылочек, дисперсионный анализ ANOVA с повторными измерениями с тестом Тьюки; F ). Ранее было показано, что клетки по латеральному краю матки являются последними, которые выходят из клеточного цикла у постнатальных мышей (Burns et al., 2012b).

Сверхэкспрессия YAP-S127A в матке новорожденных мышей in vivo привела к широко распространенному вступлению в S-фазу, усилению регуляции генов-мишеней YAP-TEAD и образованию потомства, экспрессирующего маркеры HC. A-D , Доксициклин вводили на P1 и добавляли в питьевую воду плотины. EdU поставляли на P2, P3 и P4, а мешочки собирали на P5. AD , Изображения с малым увеличением показывают, что иммунореактивность YAP была более интенсивной у мышей Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + мышей ( D ) контроли ( AC ), что указывает на индукцию экспрессии YAP-S127A.Пунктирными линиями обозначена граница желтого пятна, очевидная для YAP-отрицательных HC сомов. Клетки EdU + были в изобилии в макулах Yap-S127A + / — ; Sox10 rtTA / + мышей ( D ‘ ), но были редки в других генотипах. A’-C ‘ ). Конфокальные изображения с большим увеличением ядерного слоя SC в латеральной экстрастриолярной области матки демонстрируют иммунореактивность для YAP ( A ′ ′ — D ′ ′ ) и SC-маркера Sox2 с EdU ( A ′ ′ ′ — D ′ ′ ′ ). E , Количественная оценка клеток EdU + показала, что у мышей Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + мышей значительно больше входили в S-фазу (диапазон 13–182 EdU + клеток / 10000 мкм 2 ), чем контроли из однопометного потомства ( p <0,0001, ANOVA, n = 5-11 мышей на генотип). F , Количественная оценка входа в S-фазу по утрикулярной области (ANOVA с тестом Тьюки, n = 16 утрикулов). G , H , Детенышам вводили доксициклин на P1, и матки собирали на P3 для qRT-PCR. Мишки от WT, Yap-S127A +/- и Sox10 rtTA / + детенышей объединяли в качестве отрицательного контроля. Экспрессия генов-мишеней YAP-TEAD Ctgf , Cyr61 и Ankrd1 ( G ) была значительно усилена в Yap-S127A +/- ; Sox10 rt + мышей по сравнению с отрицательным контролем (у каждой p = 0.0286, тест Манна-Уитни, n = 4 биологических повтора). Экспрессия Ccnd1 , но не Myc , значительно увеличивалась в контексте сверхэкспрессии YAP-S127A ( H ) ( p = 0,0286, тест Манна-Уитни, n = 4 биологических повтора). I-L , Доксициклин вводили Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + мышей и контрольных мышей из одного помета на P3, а EdU — на P4, P5.Мочеиспускания собирали на P24. Мыши Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + мышей содержали многочисленные клетки Myo7a + EdU + ( J , ). Myo6 + EdU + клеток ( K , K ′ ), которые редко встречались в контроле ( I , I ′ ). L . Количественная оценка показала, что клетки Myo7a + EdU + и клетки Myo6 + EdU + были значительно более многочисленными при избыточной экспрессии YAP-S127A в точке P3 (Myo7a: p = 0.0006, n = 3-8 мышей; Myo6: p <0,0001, n = 3–7 мышей). Мишки от WT, Yap-S127A +/- и Sox10 rtTA / + детенышей объединяли для использования в качестве отрицательного контроля. Данные являются средними ± стандартное отклонение. нс p > 0,05, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001.

Чтобы определить, будет ли YAP-S127A индуцировать транскрипционную активность YAP-TEAD, мы вводили доксициклин, как описано выше, и собирали матриксы на P3 для qRT-PCR.По сравнению с контрольными однопометниками, гены-мишени YAP-TEAD Ctgf , Cyr61 и Ankrd1 были активированы в матках от Yap-S127A +/- ; Sox10 rt + мышей в 32, 7 и 181 раз соответственно ( p = 0,0286, тест Манна-Уитни; G ). Экспрессия Myc не изменилась ( p = 0,4571, тест Манна-Уитни), а регулятор клеточного цикла Ccnd1 активизировался в 3 раза ( p = 0.0286, тест Манна-Уитни; H ).

Затем мы попытались определить, смогут ли пролиферирующие SCs в мышах Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + дифференцироваться как HC. Поскольку Yap-S127A +/− ; Sox10 rtTA / + щенки, которым вводили доксициклин на P1, не всегда переносили лечение, выходящее за рамки P5, мы изменили наш протокол, чтобы обойти эту токсичность и назначили уменьшенное доза доксициклина (10 мг / кг) до Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + мышей и контрольных мышей из однопометников на P3.EdU поставляли на P4, P5 и P6, а маточные материалы собирали на P24. Мыши Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + мышей содержали 7 ± 4 Myo7a + , EdU + клеток / 10000 мкм 2 , контрольные однопометники ( p = 0,0006, t (9) = 5.2, n = 3–8 мышей; I – L ). Контралатеральные матки, которые были иммуноокрашены на Myo6, содержали в 40 раз больше клеток Myo6 + , EdU + , чем контроли из одного помета ( p <0.0001, t (8) = 7,4, n = 3-7 мышей; К ). Таким образом, реактивация передачи сигналов YAP-TEAD в SC матрикса новорожденных мышей стимулирует их к образованию потомства, которое экспрессирует маркеры HC in vivo .

Активность транскрипции YAP-TEAD также может вызывать отрицательную обратную связь (Dai et al., 2015; Moroishi et al., 2015; Park et al., 2016). Сообщается, что E-кадгерин является негативным регулятором YAP в других эпителиях (Kim et al., 2011; Benham-Pyle et al., 2015), и предполагается, что он ограничивает активность YAP в SC матрикса млекопитающих (Kozlowski et al., 2020). Чтобы проверить, влияет ли экспрессия YAP-S127A на экспрессию E-кадгерина, мы вводили доксициклин Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + мышам и контрольным мышам из однопометников в точке P1. На P5 интенсивность иммуноокрашивания E-кадгерином на стыках SC-SC утроилась в мешочках Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + по сравнению с контрольными однопометниками ( p = 0.0002, t (22) = 4,4, n = 12 мышей; A – C ). В мешочках, собранных на P3 для qRT-PCR, уровни транскриптов E-кадгерина были вдвое выше, чем в контроле ( p = 0,0286, тест Манна-Уитни, n = 4; D ).

Сверхэкспрессия YAP-S127A на P1 приводила к усилению регуляции E-кадгерина в SC и приводила к увеличению плотности клеток. Доксициклин вводили мышам Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + мышам и отрицательным контролям из однопометников на P1, и матки собирали либо на P5 для иммуногистохимии, либо на P3 для qRT. A , B , Интенсивность иммуномечения E-кадгерином в капсулах Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + (мыши ) был больше, чем в генотипах отрицательного контроля ( A ). C , Количественная оценка интенсивности окрашивания E-кадгерином в SC-SC соединениях, нормализованных к уровням E-кадгерина в несенсорном эпителии в качестве внутреннего контроля ( p = 0.022, t test, n = 12 бутылок). D , Количественная оценка экспрессии мРНК Cdh2 относительно Gapdh показывает, что экспрессия удваивается у Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA отрицательных мышей / + по сравнению с rtTA отрицательными контрольными мышами / + ( p = 0,0238, тест Манна-Уитни, n = 4 биологических повтора). E , Количественная оценка макулярной области, как определено маркировкой Myo7a + , не обнаруживает значительных различий между матками из Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + мыши р = 0.21, n = 4 или 5 мышей). F , Количественная оценка показывает, что общая плотность клеток ( p = 0,033) и плотность SC ( p = 0,008) были значительно увеличены в маточках из Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + мышей по сравнению с контрольными однопометниками (тест t , n = 5-7 мышей). Плотность HC существенно не различалась между клетками мышей Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + и контрольных мышей ( p = 0.36, t тест, n = 5-7 мышей). G , H , Иммуноокрашивание маркера апикального соединения ZO-1 и маркера HC Myo7a в латеральной экстрастриолярной области матки. Клетки из матки мыши Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + матки мыши ( H ) более плотно упакованы и имеют неправильную форму апикальных доменов по сравнению с контрольными однопометниками ( G ).Данные являются средними ± стандартное отклонение. * p <0,05, *** p <0,001.

Высокая плотность клеток была предложена для инактивации передачи сигналов YAP-TEAD в развивающейся матке мышей (Gnedeva et al., 2017). Чтобы определить, преодолевает ли индукция YAP-S127A на P1 эту регуляцию, мы вводили доксициклин Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + мышей и контрольным мышам из однопометников на P1. Затем мы собрали матки в точке P5 и провели иммуноокрашивание на HC-маркер Myo7a, а также на ZO-1, чтобы очертить апикальные соединения.Площадь желтого пятна не претерпела значительных изменений в результате индукции YAP-S127A (контроль: 0,15 ± 0,02 мм 2 по сравнению с YAP-S127A: 0,11 ± 0,05 мм 2 , p = 0,208, t (7 ) = 1,4, n = 4 или 5 мышей; E ), но пространственная плотность SC увеличилась в 1,4 раза ( p = 0,008, t (10) = 3,3, n = 5–7 мышей; F – H ). Общая плотность клеток увеличилась в 1,25 раза ( p = 0.033, т (10) = 2,5), а плотность УВ не изменилась ( р = 0,36, т (10) = 0,96). Результаты показывают, что мутация серина 127 в нефосфорилируемый остаток обходила зависимое от плотности ингибирование, усиливая транскрипционную активность YAP-TEAD и заставляя SCs в матке новорожденных мышей пролиферировать.

Пролиферативный ответ на YAP-S127A снижается во время постнатального созревания

Экспрессия YAP-S127A стимулировала TEAD-зависимую транскрипцию и пролиферацию SC в матках новорожденных мышей, но было неясно, будут ли SC оставаться отзывчивыми, когда они созреют и войдут в более устойчивую форму. состояние покоя.Чтобы проверить это, мы вводили доксициклин внутрибрюшинно одной группе мышей Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + на P3, другой группе на P5 и третьей на P9. EdU вводили подкожно один раз в день в течение следующих 3 дней, а через 4 дня после доксициклина собирали матки. После индукции на P3 матки мышей Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + содержали в 95 раз больше клеток EdU + , чем контрольные однопометники.Частота вступления в S-фазу упала до менее чем половины этого уровня после индукции на P5 и снизилась до 5% от уровня P3 при индуцировании на P9 ( p <0,0001, F (2,56) = 61, двусторонний дисперсионный анализ, n = 5–16 мышей; A – G ).

Вход в S-фазу, вызванный сверхэкспрессией YAP-S127A в матке, снижается во время постнатального созревания. AF , Изображения EdU с малым увеличением, показывающие, что вход в S-фазу в тележки Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + мышей (

D10F ) снизился в зависимости от возраста.В качестве контроля использовались матки от однопометников WT, Sox10 rtTA / + и Yap-S127A +/- . На вставках — иммунореактивность YAP в маточках соответствующего возраста. G , Количественная оценка плотности клеток EdU + выявила возрастное снижение вступления в S-фазу. Двусторонний дисперсионный анализ показал значительные эффекты для генотипа, возраста и взаимодействия возраст-генотип (все p <0,0001, n = 6-16 мышей на одно условие).**** p <0,0001 (тесты множественных сравнений Сидака). нс, не значимо ( p > 0,05). H , I , Изображения с малым увеличением эксплантированных маток из P1 и P9 Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + в мышах, которые были культивированы доксициклина 10 мкг / мл и EdU в течение 72 часов. Пунктирные линии указывают границу желтого пятна, очерченную иммуноокрашиванием Sox2. J , Количественная оценка клеток Sox2 + EdU + показала, что частота входа в S-фазу была значительно ниже в маточках из P9 Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + мышей по сравнению с мышами P1 этого генотипа ( p = 0.0277, n = 6-9 бутылок). K , qRT-PCR выявила, что экспрессия генов-мишеней YAP-TEAD относительно Gapdh снижалась в зависимости от возраста независимо от генотипа. Сравнения с контролями P1 указаны следующим образом: * p = 0,016; ** р = 0,0095; Тест Манна-Уитни. n = 4-6 биологических повторов. Данные являются средними ± стандартное отклонение.

Одна из возможных мешающих переменных в этом эксперименте in vivo заключалась в том, что биологическая доступность доксициклина в ухе, как сообщается, снижается во время постнатального созревания (Walters and Zuo, 2015).Мы подтвердили, что трансген YAP-S127A экспрессировался во все моменты времени, сравнив иммунореактивность YAP в матрицах мышей Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + мышей с мышами соответствующего возраста. Контрольные группы однопометников ( A – F ). Чтобы обойти любую проблему биодоступности, мы культивировали матки из мышей P1 и P9 Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + мышей в присутствии 10 мкг / мл доксициклина и EdU в течение 72 часов.Мочеиспускатели мышей P1 содержали в 7 раз больше клеток Sox2 + EdU + , чем матки мышей P9 ( p = 0,0277, t (13) = 2,48, n = 6-9 ; H – J ), указывая на то, что постнатальные изменения созревания в маточках ограничивают пролиферацию SC в ответ на избыточную экспрессию YAP-S127A как in vivo , так и in vitro . Однако оказалось, что стриолярные СК, расположенные в центральной области матки, остаются чувствительными к YAP-S127A даже на P9 ( I ).

Чтобы определить, коррелирует ли возрастное снижение пролиферации со снижением транскрипционной активности YAP-TEAD, мы культивировали ятрицы мышей P1 и P9 с доксициклином в течение 48 часов и измеряли экспрессию генов-мишеней YAP-TEAD с помощью qRT-PCR. . Экспрессия большинства генов-мишеней снижалась с возрастом как в маточках у мышей Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + мышей и контрольных однопометников ( K ). Однако индукция YAP-S127A на P9 все еще приводила к 4-5-кратному увеличению экспрессии генов-мишеней по сравнению с контролем соответствующего возраста (каждый p = 0.0286, n = 4 биологических повтора, тест Манна-Уитни), что указывает на то, что транскрипционный ответ остался неизменным. Вместе эти данные подтверждают, что ответная реакция SCs на передачу сигналов YAP-TEAD снижается с возрастом, но не устраняется с помощью P9.

Мы исследовали паттерны экспрессии факторов транскрипции TEAD, чтобы охарактеризовать их возрастные изменения в матке. РНКоскоп FISH показал, что TEAD1 широко экспрессируется в P0, P6 и P16 ( A – C ). TEAD2 экспрессировался в матке мыши на P0, но экспрессия была ниже на P6 и почти отсутствовала на P16 ( D – F ).Связанное с возрастом подавление TEAD2 коррелирует со снижением транскрипционной активности и пролиферации YAP-TEAD и согласуется с опубликованными RNA-seq (Gnedeva and Hudspeth, 2015). Транскрипты TEAD3 и TEAD4 не обнаружены (данные не показаны). Антитело, специфичное для ядер SC, меченных TEAD1, в матках новорожденных и взрослых мышей ( G , H ). Иммуноокрашивание маток новорожденных и взрослых мышей показало, что YAP также оставался экспрессированным во взрослых SC ( I , J ), что мы подтвердили на образце человека ( K ).Продолжающаяся экспрессия YAP и TEAD1 у взрослых повышает вероятность того, что SCs в маточках зрелых млекопитающих могут оставаться чувствительными к передаче сигналов YAP-TEAD.

Уровень экспрессии TEAD2 снижался по мере старения мышей, но уровни экспрессии TEAD1 и YAP сохранялись во всей матке. A-F , Мишки мышей P0, P6 и P16 фиксировали, замораживали, делали срезы и исследовали на наличие мРНК с помощью RNAscope. Сообщение TEAD1 было обнаружено по всему телу у всех протестированных возрастов ( A – C ).Сообщение TEAD2 было обнаружено по всему телеграфу в точке P0, но оно было отклонено в зависимости от возраста ( D-F ). Шкала 100 мкм. Белые скобки обозначают стриолярный домен Cyp26b1 + . Пунктирными линиями обозначена граница между сенсорным эпителием и подлежащей стромой. Вставки, большее увеличение. Масштабные линейки 10 мкм. G – J , маркировка антител TEAD1 и YAP в матках мыши показала широкую экспрессию, которая сохранялась от новорожденного ( G , I ) до взрослого ( H ,

10 J ) этапы.Вставки: изображения ядерного слоя СК с большим увеличением ( G , H ) и апикальной поверхности ( I , J ). Масштабные линейки 10 мкм. K , Ортогональный вид матки взрослого человека, иммуноокрашенной на YAP и Myo7a с маркировкой Hoechst ядер клеток.

YAP-5SA запускает TEAD-зависимую пролиферацию в матках взрослых мышей

YAP-5SA содержит пять мутаций серин-аланин, которые позволяют ему уклоняться от ингибирующего фосфорилирования, которое приводит к цитоплазматической секвестрации и деградации (Zhao et al., 2007, 2009, 2010). Он также более эффективно стимулирует передачу сигналов YAP-TEAD, чем YAP-S127A (Zhao et al., 2009). Мы эксплантировали матриксы мышей P30 и аденовирусно трансдуцировали SC с помощью YAP-5SA. Соответствующие клетки трансдуцировали mCherry в качестве отрицательного контроля или WT YAP для оценки эффекта ингибирующего фосфорилирования. Скорость передачи SC не различалась между вирусами ( p = 0,62, F (3,12) = 0,61, ANOVA, n = 4 ядра; A ), с ~ 30% SC и <1% HC трансдуцировались в используемом титре (данные не показаны), что согласуется с предыдущими сообщениями (Burns et al., 2012c). Через 3 дня культивирования в присутствии BrdU в матрицах, трансдуцированных mCherry или WT YAP, в среднем было <2 Sox2 + BrdU + клеток ( B – F ). Напротив, матки, преобразованные с помощью YAP-5SA, в среднем составили 69 ± 56 ( p <0,0001, F (3,44) = 15, n = 10-16, ANOVA; D , F ). В клетках Sox2 + BrdU + отсутствовали пучки волос, что позволяет предположить, что они были SC, а не HC типа II (данные не показаны).

YAP-5SA проник в ядра SC и стимулировал TEAD-зависимую пролиферацию в матках мыши P30 in vitro . Мочки мышей P30 помещали в культуру и оставляли для акклиматизации в течение ночи. На следующий день аденовирус типа 5 использовали для трансдукции SC с помощью mCherry, WT YAP, YAP-5SA или YAP-5SA / S94A. Мочеиспускания поддерживали в присутствии BrdU в течение дополнительных 3 дней перед обработкой для иммуногистохимии. A , Количественная оценка не выявила существенных различий в скоростях трансдукции вирусов ( p = 0.62, ANOVA, n = 4 контейнера). B – E , Изображения с малым увеличением показали, что трансдукция происходила во всех условиях, но вход в S-фазу происходил исключительно в маточках, трансдуцированных с помощью YAP-5SA ( B′ – E ′ ). Изображения высокого разрешения ядерного слоя SC, показывающие экспрессию репортера mCherry ( B ″ –E ″ ), а также Sox2 и BrdU ( B ′ ″ — E ′ ″ ). Ядра BrdU + в матрицах трансдуцировались YAP-5SA, меченным SC маркером Sox2 ( D ‘″ ), и появлялись с более низкой плотностью, возможно, из-за межкинетической миграции ядер или морфологического нарушения. F , Количественное определение Sox2 + BrdU + клеток на матку после 3 дней культивирования. Вход в S-фазу значительно увеличивался в маточках, обработанных YAP-5SA ( p <0,0001, ANOVA, n = 10-16 матриксов). G , H , Изображения с большим увеличением ядерного слоя матки маток, преобразованные с помощью WT YAP, YAP-5SA и YAP-5SA / S94A и проанализированные через 72 часа после трансдукции. WT YAP был относительно обогащен в цитоплазматическом пространстве, окружающем ядра SC ( G ″ ), тогда как YAP-5SA и YAP-5SA / S94A были относительно обогащены ядрами SC ( H ″ , I ″ ). J , Среднее соотношение YAP N: C в маточках, трансдуцированных с помощью WT YAP (0,66 ± 0,07, среднее ± стандартное отклонение), было значительно ниже, чем у трансдуцированных с помощью YAP-5SA (0,85 ± 0,12, p = 0,0446) или YAP-5SA / S94A (0,97 ± 0,09, p = 0,0036, ANOVA с множественными сравнениями Тьюки, n = 4 контейнера). K , L , Изображения с большим увеличением SC ядерного слоя маток мышей P30, трансдуцированные с помощью WT YAP и проанализированные через 72 часа после трансдукции.Клетки, положительные по репортеру mCherry, также были помечены антителом, специфичным для YAP, который фосфорилируется по серину 127 ( K ). SC, трансдуцированные YAP-5SA, который имеет мутацию серина в аланин по серину 127, служили отрицательным контролем специфичности антитела ( L ). Данные являются средними ± стандартное отклонение. нс p > 0,05, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001.

Мы измерили отношения N: C YAP в трансдуцированных клетках, которые экспрессировали репортер mCherry. СК, трансдуцированные с помощью YAP-5SA, показали значительно более высокие отношения N: C по сравнению с СК, трансдуцированные с помощью WT YAP ( p = 0,0446, F (2,9) = 10,5, n = 4, ANOVA с тестом Тьюки ; G – J ). Кроме того, антитело, специфичное к фосфо-YAP (S127), сильно метило цитоплазму SC, трансдуцированных WT YAP, но не тех, которые трансдуцированы YAP-5SA, в которых этот эпитоп мутирован ( K , L ).Эти результаты показывают, что эктопический YAP WT фосфорилируется и удерживается в цитоплазме, тогда как YAP-5SA, у которого отсутствуют сайты ингибирующего фосфорилирования, проникает в ядра SC и способствует переходу в S-фазу.

Чтобы проверить, требуются ли факторы транскрипции TEAD для пролиферации, индуцированной YAP-5SA, мы трансдуцировали матриксы P30 с помощью YAP-5SA / S94A, который содержит мутации серина в аланин YAP-5SA плюс мутацию в остатке 94. что отменяет взаимодействие YAP-TEAD (Zhao et al., 2008).Иммунолокализация показала, что YAP-5SA / S94A значительно обогащен ядрами SC по сравнению с эктопическим YAP дикого типа ( p = 0,0036, F (2,9) = 10,5, n = 4, ANOVA с тестом Тьюки; I , J ), но повторного входа в клеточный цикл не произошло ( E , F ). В совокупности эти результаты подтверждают, что освобождение YAP от ингибирующего фосфорилирования может позволить ему способствовать TEAD-зависимой пролиферации в зрелых стриолярных SCs.

Повторный вход клеточного цикла в ответ на YAP-5SA преимущественно происходит в стриолярной области.В маточках, трансдуцированных YAP-5SA и иммуноокрашенных на BrdU и стриолярный маркер SC Tectb через 5 дней культивирования, плотность клеток BrdU + была> 3 раза выше в области Tectb + по сравнению с областью Tectb-. ( p = 0,0001, t (4) = 15.3, n = 5, парный тест t ;). Не было существенной разницы в плотности трансдуцированных SC между стриолярной и латеральной экстрастриолярной областью (латеральная: 83 ± 22; стриолярная: 83 ± 20 SC / 10 000 мкм 2 , p = 0.90, t (3) = 0,14, n = 4, парный t тест). Мы попытались определить, будут ли пролиферирующие SCs дифференцироваться в HC, однако конститутивная сверхэкспрессия YAP-5SA нарушает морфологию стриолы в культурах, сохраняющихся через 5 дней или дольше после трансдукции ( A ), что исключает такой анализ.

Рентри клеточного цикла, вызванная YAP-5SA, происходила избирательно в стриолярных СК. Мочеиспускания мышей P30 трансдуцировали YAP-5SA после периода акклиматизации в течение ночи и культивировали в течение дополнительных 5 дней с BrdU перед обработкой для иммуногистохимии. A , Большая часть вступления S-фазы произошла в стриолярной области Tectb + . B , Количественная оценка плотности клеток BrdU + показала, что пролиферирующих клеток было значительно больше в стриолярной области Tectb + , чем в экстрастриоле ( p = 0,0001, парный тест t , n = 5 упаковок). График представляет индивидуальные значения для каждой упаковки. *** р <0,001.

Условный KO для LATS1 и LATS2 стимулирует пролиферацию в постнатальных маточках мышей

LATS1 и LATS2 являются основными киназами, которые опосредуют ингибирующее фосфорилирование YAP по мотивам HXRXXS, тем самым регулируя его локализацию и стабильность (Zhao et al., 2007). Мы обнаружили иммунореактивность фосфо-YAP (S127), показатель активности LATS-киназы (Zhao et al., 2007), в SC в маточках новорожденных и взрослых мышей ( A , B ), поэтому мы предположили, что инактивация LATS1 / 2 д. приводить к повторному входу в клеточный цикл в постнатальной матке мышей.Мы использовали подход in vitro, чтобы проверить это, поскольку у мышей Lats1 flox / flox ; Lats2 flox / flox ; Plp1-Cre ERT2 у мышей развивались опухоли даже в отсутствие введения тамоксифена. Для этого мы эксплантировали клетки мышей Lats1 flox / flox ; Lats2 flox / flox и аденовирусно трансдуцировали их SC с помощью mCherry или mCherry-T2A-Cre (LATS1 / 2 cKO). Мочки культивировали в течение 7 дней с добавлением EdU на последние 2 дня для маркировки SC, которые вошли в S-фазу.В маточках от мышей P30 иммунореактивность фосфо-YAP (S127) была снижена в матрицах Lats1 flox / flox ; Lats2 flox / flox , трансдуцированных mCherry-T2A-Cre по сравнению с соседними нетрансдуцированными SC и SC. трансдуцированные одним mCherry ( C , D ), что указывает на то, что LATS1 / 2 экспрессируются в зрелых SC и опосредуют непрерывное ингибирующее фосфорилирование YAP.

Делеция LATS1 и LATS2 снижает ингибирующее фосфорилирование YAP и индуцирует пролиферацию SC в маточках новорожденных и взрослых мышей. A , B , Мишки мышей P0 и P30 иммуно метили на фосфо-YAP (S127), показатель активности киназы LATS1 / 2. Иммунореактивность фосфо-YAP обнаруживалась в SC в стриолярной и латеральной областях как на P0, так и на P30. Пунктирная желтая линия указывает линию смены полярности, разделяющую боковые экстрастриолярные и стриолярные области. C , D , Изображение апикальной поверхности матриксов с большим увеличением из P30 Lats1 flox / flox ; Lats2 flox / flox мышей, преобразованных с помощью mCherry (Control) или mA2 -Cre (LATS1 / 2 cKO) и культивировали в течение 11 дней.SCs, которые экспрессировали только репортер mCherry, проявляли аналогичные уровни иммунореактивности фосфо-YAP (S127) по сравнению с соседними SC, которые не были трансдуцированы ( C ). Уровни фосфо-YAP (S127) были ниже в SC, которые экспрессировали Cre, что позволяет предположить, что произошла делеция LATS1 и LATS2 ( D ). E , F , Мочеиспускания были эксплантированы от мышей Lats1 flox / flox ; Lats2 flox / flox на P1 и трансдуцированы с помощью mCherry (контроль) или mCherry-LATS-LATS-L2 (контроль) или mCherry-T2 2 cKO) и культивировали в течение 7 дней.EdU добавляли в течение последних 2 дней культивирования для отслеживания клеток, которые вошли в S-фазу. Немногочисленные клетки EdU + присутствовали в контрольных маточках ( E , E ‘ ), но значительное количество клеток было обнаружено в центральной области LATS1 / 2 cKO ( F , ). F ′ ). На изображениях с большим увеличением SC-слоя ( E ″ , F ″ ) показаны ядра EdU + и митотическая фигура (стрелка) в матке LATS1 / 2 cKO ( F ″ ). G , Количественная оценка клеток EdU + в контроле P1 и матрицах LATS1 / 2 cKO показывает, что LATS1 / 2 cKO значительно увеличивает вход в S-фазу по сравнению с контролями ( p = 0,018, n = 4 матрикса) . H , I , Мочеиспускатели были эксплантированы от мышей Lats1 flox / flox ; Lats2 flox / flox на P30 и трансдуцированы с помощью mCherry (контроль) или mCherry-LATS-T2A 2 cKO) и культивировали в течение 11 дней.EdU добавляли на последние 2 дня культивирования. Контрольные матки содержали небольшое количество клеток EdU + ( H , H ‘ ), и значительно больше клеток EdU + наблюдалось в стриолярном распределении матриц LATS1 / 2 cKO ( I ). , I ′ ). J , Количественная оценка показывает значительно увеличенное количество клеток EdU + в матрицах cKO P30 LATS1 / 2 по сравнению с контролем ( p = 0.0393, n = 10 контейнеров). Пунктирными линиями обозначена граница макулы. Данные являются средними ± стандартное отклонение. * р <0,05.

Мыши от P1 Lats1 flox / flox ; Lats2 flox / flox мышей, трансдуцированных с помощью mCherry-T2A-Cre, в среднем имели в 38 раз больше SCs EdU + , чем контрольные (240 ± 145 против 6 ± 3). , p = 0,018, t (6) = 3,2, n = 4; E – G ), с некоторыми ядрами EdU + , видимыми в виде митотических фигур (F ′ ′ ′).В пузырях P30 делеция LATS1 / 2 значительно увеличивает вход в S-фазу, хотя и в меньшей степени, чем в P1. После 7 DIV в матрицах LATS1 / 2 cKO в среднем было 12 ± 15 клеток EdU + , что в 4,4 раза больше, чем в контроле P30 ( p = 0,0342, t (28) = 2,73, n = 15) . Увеличение продолжительности культивирования до 11 дней привело к 17 ± 21 клеткам EdU + в матрицах LATS1 / 2 cKO, что в 9 раз больше, чем в контроле ( p = 0,0393, t (18) = 2.22, n = 10; H – J ). Плотность трансдуцированных СК существенно не различалась между матриклами P1 и P30 (P1: 62 ± 15; P30: 53 ± 27 SC / 10,000 мкм 2 ; p = 0,60, t (5) = 0,56 , n = 3 или 4). Как в утриулах LATS1 / 2 cKO P1 и P30, пролиферирующие SC располагались в стриолярном распределении ( E , F ). Т.о., LATS1 / 2 необходимы для поддержания покоя в основной субпопуляции зрелых SCs млекопитающих.

Обсуждение

Возникающая парадигма эпителиальной репарации определяет, что при повреждении YAP накапливается в ядрах растянутых клеток, где он способствует пролиферации с помощью факторов транскрипции TEAD (Guillot and Lecuit, 2013; Benham-Pyle et al., 2015; Irvine and Шрайман, 2017). Мы обнаружили, что YAP легко накапливается в ядрах SC матрикса курицы в ответ на ототоксическое и механическое воздействие, но в соответствии с видовыми различиями в регенеративной пролиферации, локализация YAP была менее чувствительна к изменению формы и острому ингибированию MST1 / 2 в SC мыши, чем в SCs мыши. куриные SC.Сверхэкспрессия варианта YAP-S127A, который может проникать в ядра, вызывает транскрипционную активность YAP-TEAD и пролиферацию SC в матке новорожденных мышей. Этот пролиферативный ответ снижался с возрастом, но до некоторой степени сохранялся в зрелых SC. Эктопический YAP WT фосфорилировался и секвестрировался в цитоплазме, но вариант YAP-5SA, у которого отсутствуют сайты фосфорилирования LATS1 / 2, проникал в ядра зрелых SC и приводил к TEAD-зависимой пролиферации в стриоле. Подтверждая важность ингибирующего фосфорилирования, делеция LATS1 / 2 снижает фосфо-YAP и вызывает пролиферацию стриолярных SCs даже в маточках взрослых мышей.Результаты показывают, что конститутивная передача сигналов с помощью киназ LATS1 / 2 необходима для фосфорилирования YAP и удержания SCs в маточках мыши в постоянном состоянии покоя. Ингибирующий путь Hippo активен в SC неповрежденной куриной матки, но инактивируется или обходится при потере HC. В целом, эти находки обеспечивают новую механистическую основу для объяснения того, почему млекопитающие и немлекопитающие различаются по своей способности заменять сенсорные HCs, и демонстрируют, что реактивация передачи сигналов YAP-TEAD может быть достаточной для индукции пролиферации SC в балансном эпителии млекопитающих.

Точный механизм, с помощью которого потеря HC приводит к активации YAP в куриных SC, еще предстоит выяснить. У кур потеря HC приводит к быстрому расширению соседних поверхностей SC (Cotanche, 1987), и мы обнаружили, что изменения формы коррелируют со степенью накопления ядер YAP (). Эти изменения формы могут нарушить каскад киназ MST1 / 2-LATS1 / 2, позволяя YAP накапливаться в ядре. Изменения формы, по-видимому, модулируют MST1 / 2 в определенных эпителиях (Varelas et al., 2010; Fletcher et al., 2018), но не другие (Kim et al., 2011; Codelia et al., 2014; Meng et al., 2015), а некоторые формы механической регуляции YAP не требуют ни MST1 / 2, ни LATS1 / 2 (Dupont et al. ., 2011; Арагона и др., 2013). Поскольку межклеточные соединения сильно регулируют передачу сигналов от гиппопотама (Karaman and Halder, 2018), потеря HC может вызывать ядерное накопление YAP в SC рыб и амфибий, чьи соединения похожи на SCs птиц в том, что они содержат мало E-кадгерина и имеют тонкую периферическую поверхность. Полосы F-актина (Burns et al., 2008, 2013).

Стрептомицин-индуцированная потеря HC не влияла на локализацию YAP в мышиных SC (). SCs мыши д. Претерпевать более значительные изменения формы, чем их птичьи аналоги, чтобы увеличить вероятность перехода в S-фазу (Collado et al., 2011a). Это соответствует нашему наблюдению, что деформации SC вызывают накопление ядер YAP в SCs млекопитающих, но в меньшей степени, чем в SCs кур (). Таким образом, изменения формы, вызванные потерей HC в матке мыши, могут быть ниже порогового значения, вызывающего накопление YAP в ядре, а дополнительные тормозящие сигналы могут ограничивать доступ YAP к ядру.

В отличие от куриных SC, острое ингибирование MST1 / 2 не влияло на локализацию YAP в мышиных SC (). Это указывает на то, что независимые от MST1 / 2 механизмы могут активировать LATS1 / 2 в SCs мышей. Сообщается, что E-кадгерин активирует LATS1 / 2 независимо от MST1 / 2 в других эпителиях (Kim et al., 2011) и экспрессируется на гораздо более высоких уровнях в SC млекопитающих, чем у птиц, рыб и амфибий (Collado et al., 2011). ., 2011б; Burns et al., 2013). Фармакологические методы лечения, которые истощают E-кадгерин из стриолярных соединений SC, также влияют на экспрессию YAP и вызывают пролиферацию SC (Kozlowski et al., 2020). Здесь сверхэкспрессия YAP-S127A в SCs млекопитающих индуцирует повышенную регуляцию E-cadherin, что может отражать отрицательную обратную связь ( A – D ). Киназы MAP4K и метаболические изменения также могут активировать LATS1 / 2 независимо от MST1 / 2 (Meng et al., 2015; Wang et al., 2015b; Nokin et al., 2016). Точное определение того, какие восходящие сигналы активируют LATS1 / 2 в SCs млекопитающих, будет способствовать усилиям по преодолению пролиферативного покоя.

Поскольку делеция LATS1 / 2 снижает ингибирующее фосфорилирование YAP и воспроизводит паттерн TEAD-зависимой стриолярной пролиферации, вызываемой сверхэкспрессией YAP-5SA, наши данные убедительно подтверждают, что LATS1 / 2 поддерживает пролиферативное покой за счет ограничения передачи сигналов YAP-TEAD.Подтверждая это мнение, недавний отчет показал, что фармакологическое ингибирование активности киназы LATS1 / 2 вызывает YAP-зависимую пролиферацию в маточках зрелых мышей (Kastan et al., 2020). Однако эти данные не исключают вклада YAP-независимых механизмов ниже инактивации LATS1 / 2, таких как разборка репрессивного комплекса DREAM (Tschöp et al., 2011).

LATS1 и LATS2 имеют перекрывающиеся функции и наиболее заметно различаются по профилям их экспрессии (Furth and Aylon, 2017).Эти результаты не различают, требуется ли одна или обе киназы для поддержания покоя SC. Точно так же YAP и его паралог TAZ имеют в значительной степени перекрывающиеся функции (Plouffe et al., 2018). Хотя мы исследовали локализацию и фосфорилирование YAP, повреждение и делеция LATS1 / 2 могут аналогичным образом влиять на TAZ.

Сверхэкспрессии YAP-S127A достаточно для стимуляции широко распространенной пролиферации и увеличения плотности клеток в матке мышей P1 (,), что согласуется с моделью, в которой зависимая от плотности клеток инактивация передачи сигналов YAP-TEAD опосредует остановку клеточного цикла в развивающихся utricle (Гнедева и др., 2017). Однако, поскольку плотность клеток на плато матки мышей около E17.5 (Gnedeva et al., 2017), модель не учитывает постнатальное снижение способности SCs преодолевать пролиферативное покой (Burns et al., 2012a). Поскольку это возрастное снижение происходит, несмотря на избыточную экспрессию YAP-S127A или делецию LATS1 / 2, данные показывают, что пролиферация SC дополнительно ограничивается возрастными изменениями, лежащими ниже ингибирующего фосфорилирования YAP, такими как подавление TEAD2 или изменения в параллельных путях, таких как каноническая передача сигналов Wnt, передача сигналов Notch, экспрессия Atoh2 и экспрессия SoxC (Gnedeva and Hudspeth, 2015; Maass et al., 2015; Wang et al., 2015a; Самараджива и др., 2018; Сайид и др., 2019).

По-видимому, множественные уровни регуляции вносят вклад в покой SC, хотя и не одинаково для всех эпителий HC. Напр., Хроматин менее доступен в SCs улитки, чем в утрикулярных SC (Jen et al., 2019), и стриолярные SCs более склонны к пролиферации, чем экстрастриолярные SC, когда ингибирующее фосфорилирование YAP обходится (, -). Скорости пролиферации стриолярных и экстрастриолярных SC незначительно варьировались между экспериментами in vivo, и in vitro, ( F, ,), возможно, из-за доступности доксициклина или условий культивирования.Постепенное ограничение входа S-фазы в стриолярную область матки после гиперэкспрессии YAP-S127A in vivo и in vitro () предполагает, что различия между стриолярными и экстрастриолярными элементами расширяются на протяжении всего постнатального созревания. Низкая скорость экстрастриолярной пролиферации в утрилах cKO P1 LATS1 / 2 может быть связана со старением эксплантата во время процессов аденовирусной трансдукции, экспрессии Cre, рекомбинации аллелей LATS1 / 2 и деградации ранее существовавших мРНК и белка LATS1 / 2 ( E – G ).YAP не более склонен к накоплению в ядрах стриолярных SCs, чем в экстрастриолярных SC после повреждения стрептомицином () или ингибирования MST1 / 2 (), предполагая, что факторы, расположенные ниже ядерной аккумуляции YAP или параллельные пути, объясняют различную реактивность. Хотя экспрессия TEAD1 и TEAD2, по-видимому, не различается между стриолярными и экстрастриолярными SCs (), их транскрипционная активность может быть однозначно ограничена в экстрастриолярных SCs (Chang et al., 2018). Кроме того, в экстрастриолярных SC могут отсутствовать сигналы, которые способствуют пролиферации ниже передачи сигналов YAP-TEAD: сообщается, что Wnt контролирует пролиферацию ниже YAP в органоидах, происходящих из предшественников улитки, которые экспрессируют Lgr5 + (Xia et al., 2020), а стриолярные СК, которые экспрессируют Lgr5 + , более чувствительны к Wnt, чем экстрастриолярные СК (Lin et al., 2015; Wang et al., 2015a; You et al., 2018). Передача сигналов рецептора ретиноевой кислоты повышается в развивающейся экстростриоле (Ono et al., 2020) и может ограничивать там пролиферацию, что согласуется с его ролью в обеспечении выхода из клеточного цикла и дифференцировки в нейральных предшественниках (Janesick et al., 2015).

Регенеративная пролиферация важна для митотической замены HCs и пополнения пула SC после прямой трансдифференцировки.Остается неясным, почему SCs у позвоночных, не являющихся млекопитающими, легко пролиферируют после потери HC, а у млекопитающих — нет (Forge et al., 1993; Warchol et al., 1993; Golub et al., 2012; Bucks et al., 2017; Senn et al., 2019). Наши результаты раскрывают различия в регулировании YAP, которые могут способствовать этому различию. В то время как YAP необходим для регенеративной пролиферации в матке курицы, SCs млекопитающих, по-видимому, регулируют YAP с помощью другого механизма, который до сих пор нечувствителен к потере HC и может быть связан с постнатальным усилением межклеточных соединений, которое происходит уникально в SCs млекопитающих (Burns et al. al., 2008, 2013; Collado et al., 2011b). Мы обнаружили, что покой SCs у зрелых млекопитающих поддерживается частично за счет конститутивной активности киназ LATS1 / 2, которые фосфорилируют YAP и ограничивают его способность регулировать экспрессию генов с помощью TEAD. Подходы к ингибированию активности киназы LATS1 / 2 в конечном итоге могут быть использованы для содействия замещению утраченных HCs для лечения потери слуха и нарушений равновесия.

Для регенерации эндотелия легочных сосудов после вирусной пневмонии требуется COUP-TF2

ОБСУЖДЕНИЕ

ЭК составляют примерно 30% от общего количества клеток в легких ( 43 ), выстилают капиллярную сеть вокруг альвеол и обеспечивают полупроницаемый барьер необходим для газообмена.Легочные ЭК играют решающую роль в патогенезе вирусных повреждений легких, включая грипп h2N1 и SARS-CoV-2 ( 4 , 44 46 ), не только продолжая способствовать газообмену, но и регулируя движение лейкоцитов, влияя на коагуляцию, создавая барьер для жидкости и предотвращая распространение вируса в кровоток (виремия). Считается, что причиной повреждения ЭК при вирусной пневмонии является чрезмерное воздействие провоспалительных цитокинов, секретируемых эпителиальными клетками, лейкоцитами и макрофагами ( 4 ).Также может возникать прямая эндотелиальная инфекция некоторыми вирусами (например, птичий грипп H5N1), что может приводить к длительной активации эндотелия, повышенной проницаемости, гибели клеток и разрушению сосудов, что приводит к дальнейшему разрушению эпителиально-эндотелиального барьера ( 4 , 47 ) ). В этом исследовании мы использовали штамм PR8 вируса гриппа h2N1 A, чтобы вызвать у мышей заболевание, подобное вирусной пневмонии, которое вызывает гетерогенное повреждение, подобное так называемому DAD, описанному для повреждения легких человека ( 14 , 16 , 48 ).Наши данные подтверждают, что эндотелий легочных сосудов серьезно поврежден во время гриппа, что проявляется снижением доли ЭК и очевидным нарушением сосудистых сетей. Мы также наблюдали, что доля сосудистых ЭК все еще была ниже нормы даже после того, как мыши, казалось бы, оправились от инфекционных симптомов, что указывает на возможность необратимого повреждения или долгосрочных последствий и вероятного стойкого хронического воспаления, как это наблюдалось в других недавних исследованиях ( 48 , 49 ).Хотя и неполное, но явное выздоровление действительно происходит, если судить по хотя бы частичному восстановлению легочной функции и массы тела, что наталкивает на нашу гипотезу о том, что легочный эндотелий обладает способностью к регенерации и / или восстановлению гомеостатической функции после травмы. Наши данные четко свидетельствуют о том, что около 15% ЭК через 27 дней после заражения гриппом являются вновь образованными (включенными EdU), и отслеживание клонов подтвердило, что по существу все эти регенерированные клетки были получены из ранее существовавшего резидентного эндотелия, т.е.е., «ангиогенная» пролиферация, что согласуется с недавними исследованиями в других тканях ( 8 , 9 ). Из-за присущих трудностей визуализации легочного капиллярного сплетения остается неясным, происходит ли восстановление эндотелия легких за счет прорастания и удлинения новых сосудов из существующих сосудов (прорастание ангиогенеза) или за счет ремоделирования существующих сосудов через внутреннее разделение ранее существовавших сосудов в капиллярном сплетении ( инвагинальный ангиогенез) ( 50 ).Обе эти модели были задействованы как механизмы альвеолярной неоваскуляризации в компенсаторном возобновлении роста легких ( 51 , 52 ). Вполне возможно, что этот процесс после вирусного повреждения является ангиогенным только в том смысле, что возникающие ЭК происходят из предсуществующего эндотелия, в отличие от трансдифференцировки других типов клеток. Будущие исследования с использованием подходов к визуализации в реальном времени с высоким разрешением, вероятно, дадут представление о режиме или пространственно-временном проявлении этого ангиогенного процесса.Примечательно, что пролиферативные ЭК в основном наблюдаются в областях повреждения эпителия, отмеченных потерей клеток типа 1. ЭК, безусловно, повреждаются в этих же регионах, и пролиферации выживших ЭК в этих областях также могут способствовать факторы, происходящие из воспалительных клеток, присутствующих в этих поражениях. В более ранние сроки после инфицирования мы также наблюдали области, демонстрирующие более низкую экспрессию VECad рядом с деструкцией эпителия, что может быть связано с нарушением альвеолярной структуры, приводящим к местной обструкции микроциркуляции крови или гипоксической вазоконстрикции, вызывая тем самым ишемию и дополнительное повреждение периферических ЭК вблизи этого площадь.Однако эти особенности являются временными и в значительной степени отсутствуют к 27 дню. Потребуются дальнейшие исследования, чтобы определить природу временного сосудистого нарушения в этих областях. COUP-TF2, орфанный ядерный рецептор, экспрессируется в различных типах клеток во многих тканях. где он участвует в регуляции многих физиологических процессов и патологических состояний, включая мышечную дистрофию Дюшенна ( 53 ), развитие и дифференциацию во многих органах ( 54 ), фиброз печени ( 55 ), гипоплазию эндокардиальной подушки (). 56 ) и принятие судьбы венозного эндотелия в разработке ( 57 ).Причастен ли COUP-TF2 к вирусной пневмонии или повреждению легких, как правило, ранее не исследовалось. Наши данные показывают, что COUP-TF2 (Nr2f2) подавляется в ЭК легких после поражения гриппом и медленно восстанавливается одновременно с пролиферацией эндотелия. Эти результаты согласуются с исследованиями как в развивающихся коронарных артериях ( 19 ), так и в инфраренальной аорте ( 8 ), где делеция даже одной копии COUP-TF2 привела к значительной потере пролиферации ЭК ( 19 ).Примечательно, что мы обнаружили, что делеция COUP-TF2 в микрососудистых ЭК легких человека (iMVEC) ( 29 ) in vitro или у мышей с условным нокаутом COUP-TF2, специфичных для ЭК, значительно снижает пролиферацию ЭК и, в последнем случае, приводит к завышенному весу. потеря, сильно сниженная сатурация кислорода в капиллярах и повышенная смертность после инфекции гриппа. Необработанные мыши не проявляли явного фенотипа через 2 месяца после делеции COUP-TF2, вероятно, из-за состояния покоя легочных ЭК в нормальных условиях ( 58 ).Это указывает на то, что ключевая функция COUP-TF2 в эндотелии заключается в содействии митозу, роль, также предложенная недавними исследованиями в аорте, где COUP-TF2 активируется после механического повреждения в артериальных ЭК, обычно лишенных COUP-TF2, который Авторы предполагают, что это означает «возврат к более примитивной стадии, которая, возможно, была более благоприятной для входа в клеточный цикл» ( 8 ). Чрезмерное производство и высвобождение провоспалительных цитокинов, то есть «цитокиновые бури», могут происходить при тяжелых формах гриппа. пневмония и COVID-19 и признан прогностическим фактором заболеваемости и смертности ( 59 , 60 ).Эндотелий был вовлечен как центральный организатор этого феномена ( 61 ). Многие индуцированные гриппом цитокины, такие как IL-1β и TNF-α ( 25 , 26 , 62 ), действуют как мощные активаторы NF-κB и сами являются генами-мишенями NF-κB, что указывает на потенциал для неконтролируемой воспалительной активации с прямой связью ( 63 ). Наши результаты показали, что IL-1β и TNF-α ингибируют экспрессию COUP-TF2 in vitro, как и предыдущие наблюдения в других тканях ( 28 ).Мы демонстрируем, что ингибиторы NF-κB могут блокировать этот ингибирующий эффект, а ChIP-qPCR показала, что NF-κB p65 напрямую связывает область промотора COUP-TF2, что указывает на то, что подавление цитокинами COUP-TF2 опосредуется активацией NF-κB. Кроме того, цитокины, активирующие NF-κB, также способствуют усилению регуляции микроРНК-302a, которая, в свою очередь, подавляет COUP-TF2, предполагая дополнительный механизм, который может способствовать этому эффекту ( 28 ). NF-κB также может активироваться структурными белками вируса гриппа во время инфекции ( 64 ).Наши результаты, касающиеся участия оси NF-κB / COUP-TF2 в восстановлении сосудистых повреждений, вызванных гриппом, вероятно, имеют важное клиническое значение. Однако недавняя работа показывает, что регенерация альвеолярного эпителия положительно регулируется теми же провоспалительными цитокинами ( 65 ). Следовательно, EC-специфическое ингибирование передачи сигналов NF-κB, вероятно, будет необходимо для обеспечения терапевтического эффекта у пациентов с вирусной пневмонией, например, COVID-19 и гриппом, за счет поддержания эндотелиальной экспрессии COUP-TF2 и обеспечения более ранней и более эффективной репарации эндотелия.Накопленные данные показывают, что EC-специфическое ингибирование NF-κB полезно при многих патологических состояниях, включая защиту от атеросклероза ( 66 ), усиление функционального гемопоэза ( 67 ) и ослабление повреждения почек, вызванного гипертензией ( 68 ) .COUP-TF2 может функционировать либо как активатор транскрипции, либо как репрессор (в зависимости от кофакторов) посредством прямого связывания с промоторами гена-мишени в различных клеточных контекстах ( 36 ). Наши данные демонстрируют, что Ccnd1 и Nrp1 напрямую нацелены на COUP-TF2.CCND1 является критическим регулятором клеточного цикла, и потеря или репрессия CCND1 в ECs ведет к ингибированию пролиферации ( 37 ), тогда как в нашей модели NRP1 играет большую роль в миграции EC. Первоначально NRP1 был идентифицирован как многофункциональный рецептор, экспрессирующийся в нейронах, кровеносных сосудах, иммунных клетках и многих других типах клеток, который регулирует развитие и функцию органов путем связывания структурно и функционально различных лигандов, включая секретируемые семафорины (Sema), VEGF и VEGF. члены семьи, включая фактор роста плаценты PlGF ( 69 ).NRP1 признан важным ангиогенным фактором, выступающим в качестве корецептора для VEGFA 165 ( 39 ), а передача сигналов VEGF-NRP1 необходима для ангиогенеза и функции концевых клеток в нескольких EC ( 69 , 70 ). ). Примечательно, что активация NRP1 с помощью лигандов Sema не влияет на развитие кровеносных сосудов, но вместо этого важна для поиска пути аксонов множественных популяций нейронов ( 69 ), указывая тем самым, что передача сигналов нижестоящего NRP1 зависит от лиганда. Хотя передача сигналов NRP1 требуется для физиологического ангиогенеза, аномальная или эктопическая экспрессия NRP1 также может способствовать патологическому ангиогенезу.Например, на мышиной модели ангиопролиферативной ретинопатии селективная блокада NRP1 существенно ингибировала образование новых сосудов, ограничивая болезнь ( 71 ). Кроме того, NRP1 активируется в клинических образцах опухолей ( 72 ). Недавние исследования также показывают, что спайковый белок SARS-CoV-2 также может связывать NRP1 в нейронах легочного блуждающего нерва, блокируя ноцицептивную передачу сигналов и тем самым потенциально способствуя «бессимптомному» распространению вируса ( 73 ). Наши данные демонстрируют, что COUP-TF2 управляет экспрессией NRP1, облегчая восстановление сосудов легких, хотя масса литературы предполагает, что передача сигналов NRP1, опосредованная COUP-TF2, может способствовать патологическому ангиогенезу в других контекстах заболеваний легких, возможно, при легочной гипертензии или ангиогенезе опухоли легких.VEGFA является мощным медиатором как ангиогенеза, так и васкулогенеза у плода и взрослого, причем VEGFA 165 является наиболее распространенной и мощной изоформой ( 74 ). Опосредованный аденовирусом перенос гена VEGFA 165 усиливает заживление ран, способствуя ангиогенезу in vivo ( 75 ). Было хорошо продемонстрировано, что VEGFA 165 может усиливать последующие события ангиогенеза посредством передачи сигналов NRP1 / VEGFR2 ( 76 , 77 ). Наши результаты показывают, что нокдаун COUP-TF2 приводит к подавлению NRP1, ослаблению опосредованного VEGFA 165 фосфорилирования VEGFR2 и, в конечном итоге, к ингибированию пролиферации и миграции вниз по течению.Сверхэкспрессия COUP-TF2 не приводила к значительному усилению VEGFA / NRP1 / VEGFR2-опосредованных последующих ангиогенных событий. Однако, поскольку COUP-TF2 также непосредственно активирует CCND1, чтобы способствовать вхождению в клеточный цикл, вполне вероятно, что клеточно-автономное увеличение пролиферации из-за повышающей регуляции CCND1 просто подавляло любые дополнительные эффекты, опосредованные NRP1 in vitro. Таким образом, in vivo эффекты COUP-TF2 во время репарации эндотелия, вероятно, опосредуются как клеточно-автономными (CCND1), так и не клеточно-автономными (VEGFA / NRP1 / VEGFR2) путями.Поскольку COUP-TF2 в принципе является связыванием лиганда, идентификация конкретного лиганда COUP-TF2 вполне может служить потенциальным терапевтическим вариантом для некоторых вирусных пневмоний или ОРДС. Хотя специфические лиганды для COUP-TF2 еще не идентифицированы, было показано, что ретиноиды могут стимулировать COUP-TF2 для привлечения коактиваторов и активации репортерной конструкции COUP-TF2, хотя необходимая концентрация выше, чем физиологические уровни ретиноевой кислоты ( 78 ). Возникает вопрос, стоит ли изучать и перепрофилировать молекулы ретиноидов, одобренные Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, в качестве эндотелиально-ориентированного лечения тяжелого повреждения легких.Недавняя работа идентифицировала специализированное подмножество капиллярных ECs в легких мышей, отмеченных экспрессией Car4 (карбоангидраза 4). Эти клетки, по-видимому, специализируются на обеспечении высокоэффективного газообмена, отчасти из-за их близкого расположения к альвеолярным клеткам 1 типа без вмешательства перицитов и их чрезвычайно тонкой базальной мембраны ( 18 ). Псевдовременный анализ одиночных транскриптомов ЭК предполагает, что как эти клетки, так и традиционные микрососудистые капилляры способны к пролиферации после поражения гриппом, а визуализация показала, что ЭК Car4 + обогащены в наиболее сильно поврежденных альвеолах после инфицирования ( 79 ).Эти клетки зависят от VEGFA, происходящего из эпителия, и неспособность определить эти клетки во время развития приводит к подобному эмфиземе альвеолярному увеличению. Было бы интересно определить, требуется ли COUP-TF2 для восстановления этой популяции после вирусного повреждения, о чем может свидетельствовать их зависимость от VEGFA.

У этих исследований есть несколько заметных ограничений, на которые следует обратить внимание в будущей работе. Хотя мы ожидаем, что эти результаты будут обобщены на другие этиологии повреждения легких, возможно, что другие патогены или стерильные повреждения вызывают различные способы восстановления эндотелия, которые необходимо будет определять в каждом конкретном случае.Хотя нативные EC являются единственным источником восстановления эндотелия после гриппа, неясно, обладают ли все EC одинаково «мощными» для повторного входа в клеточный цикл после повреждения или могут существовать специализированные подмножества предшественников. Более того, хотя мы воспроизводим наши результаты in vivo на мышах с микрососудистыми клетками легких человека in vitro, тем не менее, в настоящее время невозможно окончательно продемонстрировать, что эти результаты полностью повторяются в патогенезе легких человека in vivo.

Таким образом, наши исследования создают основу для модели восстановления легочных сосудов после вирусной пневмонии или ОРДС.Наша демонстрация того, что ангиогенная пролиферация является основным способом восстановления сосудов, позволит в будущих исследованиях сосредоточиться на самом эндотелии как на источнике регенерации капилляров, хотя оставляет открытой возможность того, что особые подмножества клеток-предшественников в нативном эндотелии вносят особенно важный вклад. Мы также идентифицируем COUP-TF2 как критическую молекулярную мишень, с помощью которой можно улучшить восстановление сосудов легких для улучшения выживаемости пациентов после вирусного повреждения легких.Следовательно, эти исследования должны послужить основой для будущих подходов, разработанных для стимулирования регенерации эндотелия и повышения потенциала ЭК для обеспечения эффективного восстановления легких и предотвращения смертности при ОРДС. Поскольку для правильной функции легких требуется синергетическое взаимодействие эпителиальных, стромальных, эндотелиальных и иммунных клеток, эндотелию необходимо уделять должное внимание в будущих усилиях по обеспечению и усилению регенерации легких после тяжелой травмы, вирусной или иной.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Целью этого исследования было изучить повреждение сосудов легких и выявить механизмы восстановления во время вирусной пневмонии с использованием мышиной модели повреждения легких, вызванного вирусом гриппа.Для исследований in vivo экспериментальные и контрольные животные конкретно описаны как таковые в результатах и ​​в подписях к фигурам. Контрольные мыши для экспериментов по делеции COUP-TF2 in vivo (COUP-TF2 EC — / — ) представляли собой примерно равную смесь мышей COUP-TF2 flox / flox без Cre и мышей VECad CreERT2 , несущих только WT COUP-TF2. аллели. Контрольных животных всегда лечили одинаково, включая одинаковую дозировку тамоксифена (см. Ниже). Для исследований in vitro экспериментальными образцами были COUP-TF2 KO или iMVEC со сверхэкспрессией и iMVEC, обработанные указанными молекулами, или первичные EC легких человека, трансфицированные si-Nr2f2.Контрольные образцы представляли собой соответствующие пустые трансдуцированные вектором iMVEC и / или обработанные носителем (диметилсульфоксид или PBS в зависимости от реагента) iMVEC или первичные EC легких человека, трансфицированные siRNA отрицательным контролем (si-NC). Размер выборки определялся доступностью и предыдущим опытом проведения экспериментов по заражению гриппом на мышах. Никакие выбросы не были исключены из исследования. Для исследований, включающих статистический анализ, использовали не менее трех животных в группе, а n для индивидуальных экспериментов указан в подписях к рисункам.Ослепление выполняли во время сбора и анализа данных, когда это было возможно, с учетом различий в выживаемости и потере массы тела в обработанных и необработанных группах. Для каждого эксперимента размер выборки отражает количество независимых биологических повторов.

Животные и лечение

Мышей COUP-TF2 flox ( 24 ) и мышей lsl-Ai14-tdTomato (lsl-tdTomato) ( 80 ) скрещивали с мышами VECad CreERT2 (Cdh5 ) CreERT2 (Cdh5 ) CreERT2 81 ). Эти скрещивания дали мышей VECad CreERT2; lsl-tdTomato и мышей VECad CreERT2 ; COUP-TF2 flox / flox .Мышам VECad CreERT2; lsl-tdTomato вводили три дозы тамоксифена с массой тела (0,25 мг / г) в 50 мкл кукурузного масла через день с последующими 3 неделями «преследования» после последней инъекции. VECad CreERT2 ; COUP-TF2 flox / flox Мышам вводили пять доз тамоксифена (0,25 мг / г) в 50 мкл кукурузного масла через день и отдыхали от 2 до 8 недель после последней инъекции, в результате в EC-специфической делеции COUP-TF2 у взрослых мышей (COUP-TF2 EC — / — ).После этого вирус гриппа A / h2N1 / PR / 8 вводили интраназально в дозе от 50 до 60 единиц средней инфекционной дозы тканевой культуры мышам (от 20 до 25 г, 50 единиц; от 25 до 30 г, 60 единиц), как описано ранее (). 50 , 80 ). Мышам контрольной группы вводили такой же объем PBS. Мышей взвешивали три раза в неделю и умерщвляли в указанные моменты времени для сбора ткани. В этом исследовании использовали всех мышей в возрасте от 6 до 8 недель, и мышей обоих полов использовали в равных пропорциях.Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами, установленными комитетами по уходу и использованию институциональных животных Пенсильванского университета, и в соответствии со всеми правилами Управления лабораторных животных Национального института здравоохранения (NIH).

Редактирование CRISPR-Cas9 in vitro.

гРНК, нацеленных на человеческий COUP-TF2 для опосредованного Cas9 разрушения CRISPR, были разработаны с использованием программного обеспечения Benchling. Последовательности гРНК перечислены в таблице S1. Трансдукция лентивирусной gRNA + Cas9 следовала предыдущему протоколу и с соответствующей модификацией ( 83 ).Вкратце, олигонуклеотиды gRNA были синтезированы, отожжены и лигированы в плазмиду LentiCRISPR V2-Puro (Addgene). Лентивирус получали котрансфекцией лентивирусных плазмид с плазмидами psPAX2 (Addgene) и pMD2.G (Addgene), упаковывая плазмиды в 60-80% конфлюэнтных клеток 293FT с использованием полиэтиленимина в соответствии с протоколом производителя. Лентивирусный супернатант собирали через 48 и 72 часа после трансфекции и использовали для трансдукции iMVEC в присутствии полибрена (10 мкг / мл) (MilliporeSigma, # TR-1003-G).Стабильные линии клеток COUP-TF2 KO (COUP-TF2-KO iMVEC) отбирали по устойчивости к пуромицину (2 мкг / мл) в течение 7 дней и использовали для последующих исследований.

Условия культивирования клеток

Первичные микрососудистые ЭК легких человека были предоставлены S.H. Randell (Институт легких Марсико, Университет Северной Каролины в Чапел-Хилл, США). Клетки были получены по протоколу № 03-1396, одобренный Биомедицинским наблюдательным советом Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл, как описано ранее ( 84 ).Все доноры или их уполномоченные представители предоставили информированное согласие на исследовательское использование эксплантированных легких. Вкратце, микрососудистые ЭК легкого человека получали перевариванием диспазой и эластазой периферической легочной ткани, лишенной висцеральной плевры, с последующим первичным культивированием в среде EGM-2 с фетальной бычьей сывороткой (Lonza). Клетки подвергали двум или трем раундам очистки гранул CD31 (Dynabeads, Life Technologies / Invitrogen, # 11155D), после чего они имели> 95% CD31 + , как измерено проточной цитометрией и использовалось между пассажами 5 и 10.iMVEC были подарены Н. Мангалмурти. pLV-mNr2f2 (VectorBuilder, # VB1-1154eaz) использовали с плазмидами pMD2.G и psPAX2 для получения лентивирусных частиц для создания стабильной линии клеток iMVECs COUP-TF2-OE. Стабильные клеточные линии отбирали по устойчивости к пуромицину (2 мкг / мл) в течение 7 дней. Все клетки культивировали в среде для роста эндотелия (Lonza, # CC-3202). Клетки 293FT (Thermo Fisher Scientific) культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (Thermo Fisher Scientific, # 11965118), содержащей 10% космической телячьей сыворотки (CC; HyClone, # Sh4008704) и 1% пенициллин / стрептомицин (P / S; Gibco, № 15140122).В зависимости от эксперимента iMVEC обрабатывали BAY-117082 (5 мкМ; Cayman Chemical, # 10010266), JSH-23 (5 мкМ; Cayman Chemical, # 15036), рекомбинантным человеческим TNF-α (100 нг / мл; ProSpec, # CYT-114), рекомбинантный человеческий IL-1β (100 нг / мл; ProSpec, # CYT-094), рекомбинантный VEGFA 165 (20 нг / мл; PeproTech, # 100-20), ATWLPPR пептид TFA (100 мкМ ; MedChemExpress, # HY-P1663A) или управление транспортным средством.

Получение суспензии целых клеток легкого

Легкие собирали у мышей и получали суспензии отдельных клеток, как описано ранее ( 82 ).Вкратце, легкие тщательно перфузировали холодным PBS через левое предсердие для удаления остаточной крови в сосудистой сети. Доли легких отделяли, собирали и расщепляли диспазой II (15 Ед / мл) (Thermo Fisher Scientific, # 17105041) в PBS в течение 45 минут при комнатной температуре и механически диссоциировали пипеткой в ​​сортирующем буфере (DMEM + 2% CC + 1. % P / S; обозначается как «SB»). Затем клеточные суспензии фильтровали через сетчатый фильтр для клеток размером 40 мкм (Thermo Fisher Scientific, # 352340) и обрабатывали буфером для лизиса эритроцитов (Thermo Fisher Scientific, A1049201) в течение 5 минут, и клеточную суспензию инкубировали в SB, содержащем 1 : 1000 дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I) (MilliporeSigma, # D4527) в течение 45 мин при 37 ° C.Затем для последующих экспериментов использовали суспензии цельных клеток легкого.

Сортировка клеток с активацией флуоресценции

Суспензии единичных клеток всего легкого получали, как указано выше, а затем блокировали в SB, содержащем 1:50 TruStain FcX (антимышиное CD16 / 32) антитело (BioLegend, # 101319) в течение 10 минут при 37 °. С. Суспензию клеток окрашивали с использованием конъюгированного с аллофикоцианином (APC) / Cy7 крысиного антитела против CD45 мыши (1: 200; BioLegend, # 101319), конъюгированного с Alexa Fluor 488 крысиного антитела против CD31 мыши [молекула 1 адгезии эндотелиальных клеток тромбоцитов (PECAM1 )] антитело (1: 200; BioLegend, MEC13.3, # 102513) в течение 45 мин при 4 ° C. Затем окрашенные клетки и контроли «флуоресценция минус один» ресуспендировали в SB + 1: 1000 ДНКаза + 1: 1000 Draq7 (BioLegend, # 424001) в качестве живого / мертвого красителя. Вся сортировка FACS выполнялась на сортировщике BD FACSAria Fusion Sorter (BD Biosciences).

Внутриклеточный анализ FACS

Для внутриклеточного цитометрического потока EdU C57BL / 6 мышам внутрибрюшинно вводили EdU (50 мг / кг; Santa Cruz Biotechnology, # sc-284628) в указанные моменты времени.После эвтаназии суспензию единичных клеток всего легкого готовили, как описано выше, и фиксировали 3,2% параформальдегидом (PFA) (Electron Microscopy Sciences, # 15714-S) в течение 15 минут, дважды промывали, используя 3% бычий сывороточный альбумин (BSA) (в PBS) и проницаемость с использованием 0,1% Triton X-100 (в PBS) в течение 15 мин. EdU был обнаружен с помощью реакции Click-iT в сочетании с азидом Alexa Fluor 647 в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen, # C10086). Для анализа клонов VECad-CreERT2 суспензии клеток легких готовили, как указано выше.Клетки блокировали в SB, содержащем 1:50 TruStain FcX (против мышиного CD16 / 32) антитела (BioLegend, # 101319) в течение 10 минут при 37 ° C. Суспензию клеток окрашивали, используя APC / Cy7-конъюгированные крысиные антитела против мышиного CD45 (1: 200; BioLegend, # 101319), крысиные антитела против мышиного CD31 (PECAM1), конъюгированные с Alexa Fluor 488 (PECAM1) (1: 200; BioLegend, MEC13). .3, # 102513) в течение 45 мин при 4 ° C. Анализ внутриклеточного кровотока выполняли на проточном цитометре BD FACS Canto II (BD Biosciences).

Иммунофлуоресценция

Для срезов ткани легкие выделяли и обрабатывали, как описано ранее ( 50 ).Свежесрезанные легкие мыши фиксировали, заключали и разрезали на криосрезы толщиной 7 или 50 мкм (для конфокальной микроскопии) и дополнительно фиксировали еще 5 мин с 3,2% PFA. Для иммуноокрашивания в экспериментах in vitro клетки культивировали на предметных стеклах 24-луночной камеры. В конечной точке эксперимента клетки фиксировали 3,2% PFA в течение 15 мин. Включение EdU анализировали с использованием реакции Click-iT, связанной с азидом Alexa Fluor, в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen, # C10086) с последующим иммуноокрашиванием.И срезы тканей, и образцы клеточных культур были заблокированы в PBS + 1% BSA (Gold Biotechnology, # A-420-100), 5% ослиной сыворотке (Sigma-Aldrich, # D9663), 0,1% Triton X-100 и 0,02% азид натрия в течение 1 часа при комнатной температуре. После этого на предметные стекла зондировали первичные антитела (CD45 1: 200, BioLegend, # 103107; CD31 1: 200, BioLegend, # 102513; VECad 1: 200, R&D systems, # AF1002-SP; hSox17 1: 400, R&D systems, # AF1924-SP; COUP-TF2 1: 200, Abcam, # ab211777; Ki67 1: 500, Thermo Fisher Scientific, # 41-5698-82; ERG 1: 2000, Abcam, # ab; RAGE 1: 1000, R&D systems , # MAB1179) и инкубировали в течение ночи при 4 ° C.На следующий день предметные стекла промывали и инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с флуорофором (обычно конъюгатами Alexa Fluor, Life Sciences) в разведении 1: 1000 в течение ≥1 часа. Наконец, слайды снова промывали, инкубировали с 1 мкМ 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) в течение 5 минут и закрепляли с помощью ProLong Gold (Life Sciences, # P36930). Изображения были получены с помощью микроскопа Dmi8 (Leica) и проанализированы с помощью программного обеспечения LAS X (Leica) и ImageJ (NIH).

Гистологический анализ

Срезы ткани легкого зафиксированы 3.2% PFA окрашивали гематоксилином и эозином с помощью программы Penn Vet Comparative Pathology core, а затем отображали с помощью микроскопа Leica DMi8.

Количественное определение общего белка в ЖБАЛ

Была обнажена трахея и введен катетер 20 калибра для лаважа. Холодный PBS (1 мл) закапывали в легкие мыши и осторожную аспирацию повторяли три раза. Общий белок в BALF определяли с помощью колориметрического анализа бицинхониновой кислоты (BCA) ( 85 ) с использованием набора Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, # 23227).

Пульсоксиметрия

Повторные измерения периферического насыщения кислородом (SpO 2 ) проводились с использованием пульсоксиметра MouseOx Plus для крыс и мышей и датчика малого воротника MouseOx (Starr Life Sciences Corp.). Мышей брили вокруг шеи и плеч, где находится датчик ошейника. Записи были сделаны с использованием программного обеспечения MouseOx Premium (Starr Life Sciences Corp., Окмонт, Пенсильвания, США). Измерения проводились непрерывно в течение> 3 минут с частотой измерения 15 Гц. Измерения были импортированы в Microsoft Excel, и все показания с ненулевым кодом ошибки были отфильтрованы.Среднее значение этих безошибочных показаний было использовано для расчета показаний SpO 2 для каждой мыши в каждый заданный момент времени.

трансфекция siRNA

РНК-интерференция — опосредованный нокдаун гена выполняли с использованием проверенного si-Nr2f2 (Thermo Fisher Scientific, # 43). После того, как клетки достигли 60-80% слияния, первичные ЭК на 5-м пассаже трансфицировали 50 пмоль si-Nr2f2 или si-NC (Thermo Fisher Scientific, # 43) в течение 48-72 часов с использованием реагента для трансфекции липофектамина RNAiMAX (Invitrogen, №13778030) согласно протоколу производителя.Эффективность нокдауна подтверждена методами количественной ПЦР и иммуноокрашивания.

CCK-8

Анализы пролиферации клеток проводили с использованием CCK-8 (Dojindo, # CK04-05) в соответствии с протоколом производителя. iMVEC засевали 1 × 10 5 на лунку в 96-луночный планшет с указанной обработкой в ​​течение 0, 24, 48 и 72 часов; клетки обрабатывали 100 мкл DMEM / F-12 с реагентом CCK-8 (1:10, об. / об.) и инкубировали в течение 2 часов. Для оценки количества клеток оптическую плотность каждой лунки измеряли при длине волны 450 нм с использованием считывающего устройства для микропланшетов (Bio-Rad).

Анализ миграции

Анализ заживления ран или миграции выполняли путем посева 6 × 10 4 клеток в лунку «Культура-вставка 2» в соответствии с рекомендациями производителя (там же, № 80209). После присоединения клеток вставку удаляли и добавляли среду с низким содержанием сыворотки (<1%). Изображения были получены сразу после удаления вставки (0 часов) и через 24 часа для конечной точки. Расстояние миграции (в микрометрах) измеряли с помощью программного обеспечения LAS X (Leica).

Вестерн-блоттинг

Общий белок из клеток экстрагировали лизисом в буфере для анализа радиоиммунопреципитации (Sigma-Aldrich, # R0278) с коктейлем ингибиторов протеаз (Cell Signaling Technology, # 5872).Концентрации белка определяли с использованием набора для анализа белка BCA (Thermo Fisher Scientific, # 23227). Образцы с равным количеством белка фракционировали на SDS-полиакриламидных гелях (Bio-Rad, # 4561084), переносили на поливинилидендифторидные мембраны (MilliporeSigma, # IPVH00005) и блокировали 5% обезжиренным молоком (Cell Signaling Technology, # 9999s) в TBST (0,1% Твин 20 в трис-буферном физиологическом растворе) в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Затем мембраны инкубировали при 4 ° C в течение ночи с первичными антителами [фосфо-VEGFR2 (Tyr 1175 ) 1: 1000, Cell Signaling Technology, # 3770; VEGFR2 1: 1000, Cell Signaling Technology, № 9698; COUP-TF2 1: 1000, Abcam, # ab211777; Nrp1 1: 1000, ABclonal, # A16697; Ccnd11: 1000, ABclonal, # A19038; β-актин 1: 50000, ABclonal № AC026].После промывания мембран TBST инкубации с разведением 1: 4000 (об. / Об.) Вторичных антител проводили в течение 2 часов при комнатной температуре. Экспрессию белка детектировали с использованием системы ChemiDoc XRS + (Bio-Rad). β-Актин использовали в качестве контроля нагрузки. Полосы иммуноблоттинга анализировали на оптическую плотность с использованием программного обеспечения ImageJ (NIH).

ChIP assay

Мы следовали комбинированному протоколу ChIP, основанному на протоколах для набора SimpleChIP Plus Enzymatic Chromatin IP (Cell Signaling Technology, # 9005S) и набора ChIP-IT High Sensitivity (Active Motif, # 53040).iMVEC были сшиты с использованием 1% формальдегида; хроматин был выделен из 2 млн клеток по протоколу SimpleChIP. Затем мы перешли на протокол набора ChIP-IT High Sensitivity с этого момента. Сдвиговый хроматин (120 мкг) иммунопреципитировали с использованием 5 мкг антитела класса ChIP [COUP-TF2 ( 86 ), R&D Systems, # PP-H7147-00; NF-κB p65, Cell Signaling Technology, # 8242], который уже был экспериментально подтвержден для секвенирования ChIP или равного количества контроля изотипа иммуноглобулина G (IgG) (мышиный IgG, R&D Systems, # MAB003; кроличий IgG, Cell Signaling Technology , №3900).ChIP-ДНК очищали и элюировали 150 мкл элюирующего буфера. Области промотора Ccnd1 и Nrp1 были предсказаны с использованием браузера генома Калифорнийского университета в Санта-Крус. Сайты связывания в промоторных областях были предсказаны базой данных JASPAR. Праймеры были разработаны и перечислены в таблице S1. Выделение РНК

и кПЦР

Общая РНК была экстрагирована с помощью набора ReliaPrep RNA Cell Miniprep в соответствии с рекомендациями производителя (Promega, # Z6011), а затем подвергнута обратной транскрипции в комплементарную ДНК с использованием iScript Reverse Transcription Supermix (Bio-Rad, # 1708841) .qPCR выполняли с использованием PowerUp SYBR Green Master Mix и стандартных протоколов в системе Applied Biosystems QuantStudio 6 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific). Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу использовали для нормализации РНК, выделенной из iMVEC и первичных EC; RPL19 использовали для нормализации РНК, выделенной из образцов мышей. Сравнительный метод 2 -ΔΔ C t использовали для анализа уровней экспрессии. Используемые праймеры перечислены в таблице S1.

Анализ РНК-seq

Была выделена общая РНК и проверено качество, подготовлены библиотеки ДНК и выполнено секвенирование на платформе Illumina HiSeq компанией GENEWIZ Co.Ltd. Необработанные данные (необработанные чтения) в формате fastq.gz обрабатывались через общий конвейер ( 87 ) на платформе Galaxy ( 88 ) (https://usegalaxy.org/). Вкратце, необработанные считывания (fastq.gz) обрабатывались с помощью FastqGroomer (.fastq), качество проверялось FastQC, а затем обрезанные считывания последовательностей отображались в эталонном геноме [Genome Reference Consortium Human Build 38 patch release 13 (GRCh48.p13) )] через выравниватель STAR. Затем HTSeq использовали для количественной оценки количества считываний, картированных с каждым геном.Наконец, нормализация и дифференциальное выражение были выполнены с использованием DESeq2. Список дифференциально экспрессируемых генов (DEG) использовался в качестве входных данных для последующего анализа, такого как термины онтологии генов (GO) и анализ обогащения набора генов для анализа сети известных путей для изучения взаимодействий между DEG.

Статистика

Все статистические расчеты были выполнены с использованием GraphPad Prism. Значения P были рассчитаны на основе непарных двусторонних тестов t или дисперсионного анализа (ANOVA) для многомерных сравнений.Дисперсия была проанализирована во время анализа теста t . Эти данные не включены в рукопись, но доступны по разумному запросу.

Границы | Васкуляризация тканей всего органа: проектирование дерева для развития плодов

Введение

Доступность целых органов для трансплантации по-прежнему представляет собой серьезное бремя, в то время как клинические потребности продолжают расти. В самом деле, число пациентов, которым может быть назначена трансплантационная терапия, вероятно, в будущем будет расти.Это благодаря постоянному развитию медицинских технологий, которые могут спасти жизнь, позволяя пациентам жить с хроническими заболеваниями, которые ранее были фатальными. Различные врожденные и приобретенные патологии приводят к органной недостаточности, единственное лекарство от которой — трансплантация органов. Нехватка донорских органов и осложнения, связанные с пожизненной иммуносупрессией, связанной с аллогенной трансплантацией, приводят к значительной заболеваемости и смертности (Orlando et al., 2012).

Регенеративная медицина, в частности тканевая инженерия, направлена ​​на восстановление ткани или органа, утративших свою функцию.В этой области исследований используются клетки, каркасы и стимулы, доставляемые через биореактор в растущий орган in vitro (Tresoldi et al., 2015). Тканевая инженерия как подход может представлять собой лучший доступный путь преодоления препятствий, связанных с трансплантацией органов. За последние годы интерес к этой теме вырос, о чем свидетельствуют многочисленные исследования тканевой инженерии целых органов (рис. 1). Для восстановления функции органа жизненно важно, чтобы все компартменты были сконструированы (Badylak et al., 2011), поскольку общая функция органа обусловлена ​​синергизмом его отдельных компонентов, например эпителия, мезодермы, паренхимы и сосудистой сети. Можно утверждать, что сосудистая сеть, в частности, имеет большое значение для всей органной инженерии и представляет собой главную точку связи между органом и остальным телом. Например, в органах, выполняющих эндокринную функцию, химические вещества попадают в кровоток, и, что более важно, сосудистая сеть доставляет в орган кислород и питательные вещества, необходимые для выживания.Этот последний аспект является фундаментальным в процессе тканевой инженерии всего органа, так как доставка кислорода в бессосудистую ткань будет ограничена до нескольких сотен мкм за счет диффузии газа (Jain et al., 2005). Это, безусловно, приведет к некрозу, который будет препятствовать росту органов in vitro и ограничивать выживаемость после трансплантации. В идеале сосудистая сеть тканеинженерного органа должна быть напрямую связана с сосудистой сетью хозяина, оптимально это должно происходить во время трансплантации органа посредством прямого анастомоза.В качестве альтернативы трансплантат может быть подвергнут воздействию среды, которая способствует ангиогенезу, если можно стимулировать быстрое врастание сосудистой сети хозяина в течение периода, достаточно короткого, чтобы избежать некроза ткани трансплантата, это может обеспечить сосудистую сеть, способную поддерживать выживание трансплантата.

Рисунок 1 . Количество публикаций в год по инженерии тканей целого органа по результатам поиска в Pubmed.

Функция кровеносных сосудов не ограничивается только вышеупомянутыми функциями, более того, эндотелиальные клетки играют активную роль в организации процессов, участвующих в восстановлении тканей (Ding et al., 2011; Takebe et al., 2013; Hu et al., 2014; Pellegata et al., 2015; Poulos et al., 2015; Ramasamy et al., 2015). Этот аспект имеет решающее значение в процессах регенерации и приживления целого органной инженерии и может быть легко продемонстрирован параллельным интересом к тканевой инженерии целого органа (Рисунок 1) и ангиогенезу в тканевой инженерии (Рисунок 2).

Рисунок 2 . Количество публикаций в год по ангиогенезу в тканевой инженерии по результатам поиска в Pubmed.

Чтобы сконструировать целые органы, которые могут функционировать и выжить после трансплантации, необходимо включить функциональный эндотелий. Создание правильно организованной сосудистой сети, включающей сосуды правильного размера, равномерно выступающие по всему органу, окажет огромное влияние на внедрение тканеинженерных органов в клиническую практику. Оптимальным сценарием для исследователей было бы создание методов развития эндотелиальных слоев, обеспечивающих таким образом барьер для вазомоторности и место для перфузии, которое соответствует конкретной типологии целевого органа с точки зрения эндотелиального рисунка, например нормального, фенестрированного или синусоидального. (Рафии и др., 2016).

Хотя васкуляризация органов представляет собой серьезное препятствие для клинической трансляции, было исследовано множество различных и многообещающих подходов. В этом обзоре будет представлен обзор различных применявшихся стратегий, а также будут проанализированы современные методы, применяемые к основным органам тела.

Децеллюляризация целых органов

Децеллюляризация — это полное удаление всего клеточного и ядерного материала из ткани при сохранении ее внеклеточного матрикса (Gilpin and Yang, 2017).Этот процесс обычно достигается с помощью моющих средств и ферментов в сочетании с физическим стрессом. Почти каждая ткань человеческого тела была децеллюляризована, и совсем недавно целые человеческие конечности были использованы для производства бесклеточных каркасов (Gerli et al., 2018). Этот метод имеет уникальное преимущество создания каркаса, который очень похож на естественную среду как с биохимической, так и с анатомической точки зрения (Crapo et al., 2011). Бесклеточные матрицы позволяют клеточный рост и функциональную дифференциацию, не вызывая иммунного ответа, даже в случае ксеногенной трансплантации (Fishman et al., 2013).

Естественным и очевидным развитием этого метода стала децеллюляризация целых органов (Scarritt et al., 2015). Этот подход представляет собой самый простой способ получить каркас, который точно имитирует сложную структуру органа, аспект, который имеет решающее значение для восстановления органа и восстановления его функции. Более того, органы, которые считаются непригодными с медицинской точки зрения для трансплантации из-за плохого состояния, могут представлять собой потенциальный источник органов для создания децеллюляризованных каркасов для тканевой инженерии (Peloso et al., 2015; Verstegen et al., 2017).

Интересно, что было показано, что среди различных компартментов, сохранившихся внутри децеллюляризованных органов, внеклеточный матрикс сосудистой сети не изменен и сохраняет свою структуру, что обеспечивает легкий путь доставки клеток равномерно по всему органу. Сохранение сосудистой сети было продемонстрировано в различных органах, таких как кишечник (Totonelli et al., 2012), легкие (Maghsoudlou et al., 2013), печень (Maghsoudlou et al., 2016), сердце (Ott et al., 2008) и почки (Song et al., 2013; Bonandrini et al., 2014).

Клетки для инженерии тканей всего органа

Микрососудистая сеть — важная особенность органа, необходимая для транспортировки питательных веществ, клеток крови, кислорода и продуктов жизнедеятельности. Эта сеть сложных сосудов образована процессом ангиогенеза и неоваскуляризации. Он состоит из различных взаимодействующих типов клеток, эндотелиальных клеток (ЭК), выстилающих стенку сосудов, и периваскулярных клеток или настенных клеток, в основном состоящих из перицитов (ПК) и гладкомышечных клеток сосудов (vSMC).Эти процессы имеют решающее значение во время роста и развития, травм, восстановления и ремоделирования, поскольку они зависят от взаимодействия между микрососудом и его микросредой (Bergers and Song, 2005).

При рассмотрении сосудистой сети, которая должна регенерироваться во время тканевой инженерии всего органа, наиболее важной и сложной частью для разработки является микрососудистая сеть, которая состоит из ЭК и ПК. Более того, более крупные сосуды окружены слоем vSMC, который регулирует приток крови к органу.Решающим шагом является определение наилучшего источника клеток для доставки различных анатомических структур сосудистой сети в пределах всего органа. В этом разделе основное внимание будет уделено различным стратегиям, которые были опубликованы в литературе и показали потенциал для использования в инженерии тканей целого органа.

Эндотелиальные клетки

Поиск подходящего источника эндотелиальных клеток по-прежнему остается серьезным препятствием на пути доставки васкуляризированных тканевых инженерных органов. Это особенно важно, потому что взрослые эндотелиальные клетки демонстрируют нарушенный пролиферативный потенциал после размножения.В тканевой инженерии ключевая цель — собрать первичные клетки с минимальной инвазией, культивировать и размножить эти клетки, возвращая высокий урожай, достаточный для колонизации органа. Клетки должны сохранять свои основные функции, например, эндотелиальные клетки должны ингибировать свертывание крови, способствуя анастомозу сосудистой сети хозяина. С этой целью были исследованы различные источники клеток, от первичных изолированных взрослых клеток до клеток, дифференцированных из популяций стволовых клеток или клеток-предшественников.

Классический сбор эндотелиальных клеток взрослых требует вовлечения сосудов большого диаметра. По этой причине получение ЭК у пациентов остается проблемой, вызывающей серьезные осложнения. Единственными неинвазивными источниками ЭК у взрослых людей остаются трупные сосуды и пупочная вена (Bourke et al., 1986). Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) до сих пор были золотым стандартом в исследованиях ЭК из-за их относительной простоты доступа и высокого выхода после выделения.Однако HUVEC показали плохое приживление и анастомоз при трансплантации в различные модели животных. В 2004 году с целью создания долговечных кровеносных сосудов HUVEC и мезенхимальные клетки были засеяны в трехмерном коллагеновом геле фибронектина типа 1, а затем имплантированы мышам. В этом эксперименте HUVEC смогли сформировать трубки, которые соединялись с сосудистой сетью хозяина, обеспечивая перфузию. Однако только HUVEC продемонстрировали ограниченную способность формировать сосуды и не смогли выжить в долгосрочной перспективе, хотя функциональность сосудистой сети в течение длительного периода времени в этом исследовании не оценивалась (Koike et al., 2004). Совсем недавно группа Mummery наблюдала, что HUVECs не способны встраиваться в сосудистую сеть модели ксенотрансплантата рыбок данио , а скорее прикрепляются к сосудистой сети или мигрируют по эмбриону. Следовательно, одни только HUVECs являются недостаточным источником клеток для тканевой инженерии сосудов, что делает необходимым изучение других вариантов (Orlova et al., 2014).

Эндотелиальные клетки-предшественники (EPC) могут быть выделены из периферической крови, предлагая потенциальный источник аутологичных клеток, которые можно легко собрать.EPC были впервые описаны Asahara et al. которые идентифицировали гематопоэтическую популяцию, способную вызывать постнатальный васкулогенез в периферической крови взрослых (Asahara et al., 1997).

EPC, полученные из крови, уже использовались для эндотелиализации синтетических сосудистых трансплантатов в нескольких исследованиях (He et al., 2003; Shirota et al., 2003). Трансплантаты, покрытые этими EPC, были имплантированы in vivo в модель сонной артерии собаки. Через 30 дней 11 из 12 трансплантатов оставались незаращенными, а клетки, выстилающие поверхность, демонстрировали признаки зрелого фенотипа ЭК (He et al., 2003). Пуповинная кровь (Murga et al., 2004) и костный мозг (Hamilton et al., 2004) могут представлять дополнительные источники аутологичных клеток-предшественников сосудов. Действительно, несколько исследований показали, что клетки костного мозга функционально способствуют неоангиогенезу во время заживления ран и ишемии конечностей (Majka et al., 2003), эндотелизации сосудистых трансплантатов (Shi et al., 1998) и васкуляризации органов (Otani et al. др., 2002). Дифференцированные EPC, полученные из пуповинной крови человека, засеянные на сосудистые каркасы, образовывали неоткани как в биомиметической, так и в статической среде in vitro .Эти ткани были охарактеризованы как эндотелиальные монослои со связанными функциями (например, продукция eNOS, указывающая на особенности функционального эндотелия) (Schmidt et al., 2004).

Однако существуют значительные разногласия по поводу идентичности и роли EPC в восстановлении сосудов, пуповинная кровь доступна не у всех людей, а редкость и потенциал роста этих клеток делают их непригодными для масштабного производства. По этой причине были бы полезны альтернативные источники ЭК для конкретных пациентов.

Недавно индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) были широко исследованы как многообещающий источник клеток для ЭК. Группа Маммери обнаружила, что происходящие из ИПСК человека ЭК способны образовывать кровеносные сосуды и анастомозировать с сосудистой сетью хозяина при введении в модель рыбок данио (Orlova et al., 2014). Более того, ЭК, полученные из ИПСК, смогли превзойти HUVEC, которые до сих пор считались золотым стандартом в исследованиях ЭК. Будучи многообещающим, клиническое использование ЭК, полученных из ИПСК, по-прежнему связано с опасениями по поводу туморогенного потенциала плюрипотентных клеток и их ограниченного клинического применения при дегенерации желтого пятна в сетчатке (Cossu et al., 2017).

Было бы выгодно преодолеть как ограниченный выход и доступность взрослых клеток, так и опухолегенный потенциал EC-iPSC. По этой причине не исключено, что работа, предложенная группой Рафии, будет чрезвычайно актуальной для данной области. В частности, они описали прямое превращение соматических клеток в функциональный эндотелий. Интересно, что этот подход был реализован с человеческими клетками, происходящими из околоплодных вод в середине беременности, которые были преобразованы в фенотипически стабильную и расширяемую популяцию сосудистых ЭК без перехода через плюрипотентное состояние (Ginsberg et al., 2015).

В последнее время идея о том, что ЭК служат только для выстраивания простых пассивных «трубных» систем, постепенно подходит к концу, их роль более сложна, чем просто доставка кислорода и питательных веществ, и включает в себя модуляцию свертывания крови, регулирование транспортировки воспалительных клеток. и служат привратниками клеточного метаболизма (Carmeliet and Jain, 2011; Ghesquière et al., 2014). Тканевые микрососудистые сети капилляров могут выполнять сложные физиологические задачи, такие как поддержание гомеостаза резидентных стволовых клеток и управление регенерацией и восстановлением взрослых органов, избегая фиброза.Существуют дальнейшие доказательства в поддержку идеи, что ЭК продуцируют ангиокринный фактор, обеспечивая ингибирующие и стимулирующие тканеспецифичные сигналы для обновления стволовых клеток (Butler et al., 2010; Nolan et al., 2013). Имея это в виду, процессы тканевой инженерии, основанные на использовании стволовых клеток, могут выиграть от создания соответствующей эндотелиальной ниши. Это может обеспечить идеальную среду для повторения сложных сигнальных сетей, способных управлять регенерацией органов.

Перициты

ЭК являются основным компонентом сосудистой сети, которые были тщательно изучены и охарактеризованы, в то время как перициты в настоящее время становятся ключевыми регуляторами ангиогенеза.Хотя отцовство перицитов обычно приписывается Руже в 1874 г. (Rouget, 1874). Клетки Руже с тех пор были переименованы в перициты, ссылаясь на их анатомическую локализацию в непосредственной близости от эндотелиального слоя Циммерманном в 1923 г. (Zimmermann, 1923). Периэндотелиальное расположение перицитов часто путают с периэндотелиальным расположением сосудистых гладкомышечных клеток, фибробластов и макрофагов (Armulik et al., 2011). Хотя все придерживались точки зрения, что перициты принадлежат к одному и тому же клону vSMCs, широко признано, что не существует единственного молекулярного маркера, который позволяет нам однозначно отличить их от vSMCs или других мезенхимальных клеток.Кроме того, экспрессия маркеров, используемых для идентификации перицитов, является временной и непостоянной, действительно, разные перициты могут экспрессировать разные наборы маркеров, и эта экспрессия может изменяться на протяжении жизни одной и той же клетки (Armulik et al., 2011). Из-за этой неоднородности и разнородности маркеров невозможно полностью установить идентичность перицитов, и единственное четкое определение относится к их анатомическому расположению. В настоящее время клетки, определяемые как перициты, локализуются в базальной мембране сосудов, как видно с помощью электронной микроскопии (Miller and Sims, 1986).

Однако это определение теряет силу в условиях активного ангиогенеза, например, во время эмбриогенеза и регенерации тканей, когда четкая идентификация этих перицитов становится еще более трудной. Также широко признано, что перициты чаще встречаются в непосредственной близости от микрососудов (капилляров, венул и терминальных артериол), где они разделяют базальную мембрану с эндотелиальными клетками и связаны плотными, щелевыми и прикрепленными соединениями. В самом деле, один перицит может быть связан с несколькими эндотелиальными клетками посредством клеточных выступов, которые окружают кровеносный сосуд и проходят вдоль него (Gerhardt and Betsholtz, 2003; Kovacic and Boehm, 2009).Однако даже это определение было поставлено под сомнение наблюдениями за субэндотелиальными перицитоподобными клетками в крупных сосудах (Díaz-Flores et al., 2009). Хотя в этой области существует много спорных аспектов, все большее количество исследований предполагает, что перициты могут быть предшественниками vSMC и могут представлять собой мультипотентные клетки-предшественники, такие как предшественники адипоцитов (Olson and Soriano, 2011), остеобласты, хондроциты (Collett and Canfield, 2005). ) и стволовые клетки скелетных мышц (Dellavalle et al., 2007). Это напоминает поведение мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и, следовательно, это привело к концепции периваскулярной ниши МСК (Armulik et al., 2011).

Лаборатория Паоло Бьянко аргументировала эту теорию и широко распространенное мнение о том, что МСК повсеместно встречаются в соединительной ткани человека, что определяется общим фенотипом in vitro и совпадает с повсеместными перицитами. Они сообщили, что повсеместно распространенных МСК с идентичной емкостью не существует, но что «тканеспецифичные» предшественники мезодермы способны рекрутировать судьбу настенных клеток, обеспечивая вероятный механизм образования перицитов и то, как они служат источником местные клетки-предшественники (Sacchetti et al., 2016). Вместе эти соображения предоставляют доказательства того, что перициты являются мощным инструментом регенерации тканей, поскольку они могут способствовать восстановлению слоя гладких мышц сосудов, который, как известно, необходим для функционального и зрелого эндотелия (Bergers and Song, 2005), а также мезодермальное соединение ткани, из которой они происходят. Тем не менее, невозможно исключить теорию о том, что эти клетки могут способствовать регенерации гладкомышечного соединения органов из-за их способности по умолчанию дифференцироваться в vSMCs, которые не имеют четких отличий от несосудистых гладкомышечных клеток.

Независимо от своего происхождения, широко признано, что периваскулярные клетки играют важную роль на ранних этапах ангиогенеза. Хотя начальные отростки эндотелиальных клеток могут формироваться без вовлечения перицитов, перициты являются одними из первых клеток, которые проникают в вновь васкуляризированные ткани, и обнаруживается, что они располагаются на растущей передней части отростков эндотелия. Перициты могут подавлять рост эндотелия, миграцию и стабилизацию микрососудов (Bergers and Song, 2005; von Tell et al., 2006), более того, участие перицитов также непосредственно участвует в обеспечении устойчивости капилляров к регрессии in vivo . По этой причине все большее количество исследований сосредоточено на этих типах клеток с целью инженерии сосудистой ткани. В качестве источника перицитов для тканевой инженерии новаторское исследование, проведенное группами Bianco и Cossu, показало, что клетки, выделенные из эмбриональной дорсальной аорты мыши, относящиеся к периваскулярному клону (по экспрессии CD34, Flk-1, SMA и c -Kit), способны генерировать in vivo как сосудистых, так и внесосудистых мезодермальных производных.По этой причине эти клетки были названы мезоангиобластами (МАБ) (Minasi et al., 2002). Однако MAB, происходящие из взрослых тканей, теряют свои эндотелиальные свойства и поэтому считаются клетками, происходящими из перицитов. Клетки со схожими характеристиками могут быть выделены из биоптатов скелетных мышц, и они способны дифференцироваться по линии гладких мышц (функция перицита по умолчанию) и скелетных мышц (как мезодермальная линия происхождения) (Dellavalle et al., 2011). Подобно тому, что мы обсуждали выше, перициты могут происходить из плюрипотентных стволовых клеток.Протокол получения MAB-подобных стволовых / предшественников клеток из ИПСК человека и мыши был недавно разработан (Gerli et al., 2014). Соответственно, были также определены определенные условия для одновременного получения ЭК и ПК из hiPSC различного тканевого происхождения с высокой эффективностью (Orlova et al., 2014).

Клетки гладких мышц сосудов

С точки зрения тканевой инженерии всего органа, весь спектр сосудов разного размера, которые образуют сосудистое дерево, должен быть регенерирован, потому что микрососудистая сеть сама по себе не может поддерживать функцию органа.В самом деле, гладкомышечные клетки, которые представляют собой основное различие между микрососудом и более крупными сосудами, играют решающую роль в обеспечении функции сосудистой сети. Они доставляют сосуды и вносят вклад в биомеханическую реакцию кровотока (Neff et al., 2011). Следовательно, получение и культивирование клеток гладких мышц сосудов представляет собой значительный шаг к регенерации всей сосудистой сети.

Различные подходы были использованы для поиска подходящего и надежного источника клеток, который мог бы дать начало гладкомышечному отделу сосудов.Тем не менее, в то время как в конкретной области тканевой инженерии кровеносных сосудов, предназначенной для регенерации одного сосудистого трансплантата, много усилий было вложено в создание гладкомышечного слоя (Tresoldi et al., 2015), в области реваскуляризации всего органа есть в основном направлен на регенерацию перицитов, чтобы обеспечить стабильную микрососудистую сеть.

Мезенхимальные стволовые или стромальные клетки являются одним из наиболее широко исследуемых источников для получения VSMC. Основополагающая статья, объединяющая децеллюляризованный каркас и МСК, была опубликована Zhao et al.Они смогли получить ЭК и vSMC из МСК крупного рогатого скота, чтобы полностью развить тканеинженерные артерии, которые были трансплантированы в модель овцы в качестве интерпозиции сонной артерии, которая оставалась доступной в течение 5 месяцев (Zhao et al., 2010a). Другой пример представлен в работе Jung et al. где человеческие МСК были использованы для создания трансплантата без каркаса, который имел зрелый гладкомышечный слой (Jung et al., 2015).

Помимо МСК, стволовые клетки, полученные из жировой ткани (ADSC), представляют собой еще один широко используемый источник VSMC, поскольку их легко получить.В самом деле, этот тип клеток способен при правильных биохимических и биомеханических условиях давать начало фенотипу зрелых гладких мышц, который характеризуется сократимостью (Harris et al., 2011). По-видимому, основным вовлеченным путем является трансформация фактора роста-бета 1 (TGF-β1). Действительно, в аналогичном исследовании ADSCs были индуцированы к дифференцировке в VSMC посредством TGF-β1 и костного морфогенного фактора роста. VSMC человека, полученные из ADSC, высевали на сосудистый трансплантат малого калибра. Образовавшаяся стенка сосуда имела плотную и хорошо организованную структуру, аналогичную структуре физиологических сосудов (Wang et al., 2010).

Замечательный пример доставки гладкомышечного слоя во весь орган — это многообещающие результаты, достигнутые лабораторией Отта. В своей работе совместное засевание HUVEC и человеческих МСК в качестве периваскулярных поддерживающих клеток в децеллюляризованные каркасы легких крысы привело к широкой реэндотелиализации, но, что более интересно, в той же работе они регенерировали сосудистую сеть легких, используя как эндотелий, так и vSMC с клетками, полученными из индуцируемых плюрипотентных стволовых клеток человека, что показывает, как эти клетки могут представлять собой еще один ценный источник vSMC (Ren et al., 2015).

Более того, vSMCs, как упомянуто выше, предположительно имеют общее происхождение с перицитами, что делает источники PC, представленные в предыдущем абзаце, потенциальной клеточной популяцией для происхождения фенотипа гладких мышц. В частности, мезоангиобласты, которые представляют собой легко доступную популяцию клеток, уже используются в клинике (Cossu et al., 2015) и могут вызывать фенотип гладких мышц (Tagliafico et al., 2004), что делает их идеальным кандидатом. для регенерации гладкомышечного сосудистого слоя.Другой вариант, который был исследован, — это прямое привлечение VSMC in vivo . Этот подход работал для кровеносных сосудов диаметром 5–6 мм (Pellegata et al., 2015; Syedain et al., 2017).

Подводя итог, можно сказать, что полностью функциональная и зрелая сосудистая сеть требует как эндотелиальных, так и настенных клеток. Многие исследования, посвященные инженерии тканей кровеносных сосудов, продемонстрировали важность такого сосуществования. Однако большинство попыток регенерировать сосудистую сеть во всех органах было выполнено с использованием только ЭК, как обсуждается в следующих разделах этого обзора.Результаты, достигнутые за последние годы при совместном использовании разных типов клеток, определенно предполагают, что подход совместного культивирования более подходит для решения проблемы реваскуляризации всего органа.

Печень и поджелудочная железа

В области тканевой инженерии всего органа печень является наиболее широко исследуемым органом, одна треть исследований опубликована по печени, включая вопрос о васкуляризации. Действительно, существует соответствующая клиническая необходимость, продиктованная нехваткой доступных органов для трансплантации.Более того, анатомия печени хорошо поддается децеллюляризации, процессу, который был установлен как для печени животных, так и для человека (Mazza et al., 2015). Последующая рецеллюляризация может быть достигнута через воротную вену даже на небольших моделях животных. Действительно, воротная вена вместе с надпеченочной веной представляет собой наиболее важную сосудистую сеть, поскольку печень может выжить без артериального кровоснабжения. Тканевая инженерия печени по-прежнему остается серьезной проблемой, и на сегодняшний день получение зрелых гепатоцитов остается нерешенной задачей (Hannan et al., 2013; Leclerc et al., 2017), однако окружающая среда, в частности децеллюляризованный матрикс, по-видимому, способствует этому процессу (Lorvellec et al., 2017). Потенциально эндотелиальные клетки могут играть активную роль в тканевой инженерии печени, так как известно, что они контролируют регенерацию печени (Ding et al., 2010), действительно, группа Танигучи описала в новаторском исследовании, что трансплантация васкуляризированных зачатков печени способна воспроизвести функция органа (Takebe et al., 2013).

С точки зрения тканевой инженерии органа, основной принятой стратегией является инъекция эндотелиальных клеток, в основном HUVEC (Baptista et al., 2011; Ширакигава и др., 2013; Takebe et al., 2014; Бао и др., 2015; Verstegen et al., 2017). Новаторская работа была выполнена группой Soker в 2011 году, когда они сообщили о децеллюляризации всей печени разных видов. Кроме того, группа культивировала HUVECs вместе с фетальными клетками в каркасах печени хорьков и продемонстрировала, что регенерированный эндотелий не протекает при перфузии меченым декстраном (Baptista et al., 2011). Бао и др. культивированные HUVEC в децеллюляризованных каркасах свиней, функционализированные гепарином в течение 3 дней, демонстрируя хорошее приживление клеток, кроме того, они показали, что функционализированная децеллюляризованная печень не вызывает внезапного тромбоза при трансплантации в инфрапеченочное пространство поросят (Bao et al., 2015). Ортотопическая трансплантация печени была выполнена также группой Атала, в их исследовании MS1 повторно эндотелиализированная свиная печень поддерживала перфузию крови in-vivo в течение 24 часов, избегая образования тромбов и приводя к прорастанию сосудов, что подтверждено ультразвуковым мониторингом (Ko et al., 2015). HUVEC также использовались в другом исследовании, в котором эндотелиальные клетки динамически культивировали в течение 3 дней на децеллюляризованной печени крыс, что интересно, клетки предотвращали утечку крови при реперфузии in vitro (Shirakigawa et al., 2013). HUVEC также были протестированы на децеллюляризованной печени человека, в частности Verstegen et al. высевали HUVEC на срезы каркаса 250 мкм, достигая хорошей рецеллюляризации и подчеркивая, как матрица инструктирует клетки располагаться в сосудистой ткани (Verstegen et al., 2017). Кроме того, в другом исследовании линия эндотелиальных клеток EA HY926 была использована для рецеллюляризации бесклеточной доли печени свиньи, покрытой гелем гепарина, который способствовал адгезии и приживлению клеток. Динамическое культивирование в течение 10 дней привело к равномерному распределению клеток, и каркас не вызывал тромбоза при гетеротопической трансплантации свиньям в течение 1 часа (Hussein et al., 2016). Следует отметить, что в исследованиях Hussein et al. и Бао и др. добавление гепарина, иммобилизованного на каркасе, со временем увеличивало перфузию крови in vivo (Bao et al., 2015; Hussein et al., 2016). Перфузия в долгосрочной перспективе все еще остается основным препятствием, действительно, эти исследования показали ограниченный период времени до 3 дней после имплантации, в то время как проходимость в течение длительного периода должна быть установлена ​​для доставки клинически значимого печеночного трансплантата. Kadota et al. предложили подход, при котором полученные из костного мозга мезенхимальные стволовые клетки, посеянные в печени крысы, продуцируют проангиогенные факторы и выдерживают ортотопическую трансплантацию в течение 60 минут (Kadota et al., 2014). Это представляет собой обратный подход, в котором стратегия состоит в том, чтобы способствовать прорастанию сосудистой сети хозяина, аналогично тому, что описано в аналогичных исследованиях с использованием коллагенового геля, и демонстрирует прорастание кровеносных сосудов хозяина. В частности, в исследовании Zhao et al. коллагеновый гель был залит гепатоцитами перед подкожной имплантацией на 7 дней (Takimoto et al., 2003; Zhao et al., 2010b). Однако этот подход ограничивает размер трансплантата, поскольку врастание кровеносных сосудов не может быть достаточно быстрым, чтобы поддерживать ткани человеческого размера, избегая при этом некроза.

Поджелудочная железа, которая разделяет многие ключевые эндокринные и экзокринные функции с печенью, была децеллюляризована как единый орган, чтобы устранить возможность трансплантации островков. Было опубликовано два отчета, посвященных рецеллюляризации эндотелиальных клеток. Peloso et al. сообщили о динамической культуре децеллюляризованной поджелудочной железы человека с первичными эндотелиальными клетками поджелудочной железы человека (Peloso et al., 2016). Результаты показали приживление клеток, которые поддерживали CD31-положительный фенотип, половина засеянных клеток продолжала пролиферировать.Кроме того, Guo et al. недавно провели повторную эндотелизацию децеллюляризованной поджелудочной железы крысы с помощью EPC (Guo et al., 2018). Заселенные каркасы подкожно имплантировали мышам, демонстрирующим анастомоз с сосудистой сетью хозяина, что приводило к более высокой плотности кровеносных сосудов в трансплантате по сравнению с незасеянными каркасами.

Чтобы продолжить разработку тканевой инженерии печени и поджелудочной железы для внедрения в клиническую практику, необходимо будет доставить предварительно васкуляризованные инженерные органы, которые могли бы выдержать долгосрочное ортотопическое приживление.Особое внимание следует уделить разработке специализированного эндотелия печени, который имеет очень специфическую сосудистую сеть, специфичную для конкретного участка, которую следует воспроизвести.

Почки

Почка имеет свободный доступ к сосудам как из артериальных, так и из венозных сосудов. В качестве фильтрующего органа сосудистая сеть играет ключевую роль в функционировании органа, делая сосудистую сеть необходимой не только для выживания модифицированного трансплантата, но и для выполнения его функции. Для создания почечной сосудистой сети использовались различные клеточные источники, при этом почечная артерия является основным путем доставки клеток.

Первая попытка инженерии цельной почечной ткани была описана группой Отта. В своем исследовании они описали децеллюляризацию почек у разных видов животных, таких как крысы, свиньи и люди. Они смогли повторно заселить почки крысы с помощью HUVEC и неонатальных клеток почек крысы, достигнув пространственного распределения, которое напоминало нативные клубочки. Динамическое культивирование засеянных клеток привело к снижению сосудистого сопротивления и свидетельству сосудистой функции. В группе была выполнена краткосрочная ортотопическая имплантация инженерной почки с анастомозом обеих сосудистых ножек.Они сообщили о наличии отчетливой сосудистой сети, которая избегала образования тромбов, хотя не было четко указано, как долго трансплантат находился на месте (Song et al., 2013). Интересно, что они сообщили, что внеклеточный матрикс был способен пространственно инструктировать клетки и направлять их к правильному анатомическому расположению.

Идея поучительного ECM была также описана группой Ремуцци. В своей работе они показали, что на судьбу эмбриональных стволовых клеток мыши влияет децеллюляризованный каркас.В этом эксперименте клетки, высеянные через почечную артерию децеллюляризованной почки крысы, равномерно распределялись в капиллярных структурах. В течение 72 часов после посева клетки утратили свою плюрипотентность и, как было показано, дифференцировались в мезодермальные предшественники эндотелия (Bonandrini et al., 2014). Инструкцию эмбриональных стволовых клеток также продемонстрировали в крупных исследованиях на животных. В исследовании, предложенном Батчелдером и его коллегами, человеческие ESC были засеяны на децеллюляризованные почки макак-резусов.Через 7 дней клетки дифференцировались в специфические для почек типы клеток, включающие фракцию клеток CD31 + (Batchelder et al., 2015). Чтобы дополнительно описать, как эндотелиальные клетки могут управлять судьбой клеток, Du et al. засеяли децеллюляризованную почку мыши с предшественниками Pax-2 +, полученными из ИПСК, и эндотелиальными клетками, полученными из ИПСК. Они показали, как присутствие эндотелиальных клеток регулирует экспрессию почечных генов в клетках-предшественниках. Каркасы подкожно имплантировали мышам SCID на 12 недель.Результаты показали, что только в присутствии эндотелиальных клеток клубочки рецеллюляризовались. Более того, они показали in vitro , как эндотелиальные клетки улучшают функцию гломерулярного барьера (Du et al., 2016). Совсем недавно Бомбелли и др. производные нефросфер человека, было показано, что эти сферы содержат почечные стволовые клетки, подобные клеткам. Интересно, что при культивировании на срезах децеллюляризованной ткани они показали, что ЕСМ снова способен инструктировать нефросферы и управлять их дифференцировкой в ​​направлении эндотелиальных клеток и канальцевых структур за 30 дней (Bombelli et al., 2017). Общая реваскуляризация почек была исследована с использованием широкого диапазона различных источников клеток, демонстрируя, что внеклеточный матрикс может обеспечивать сигналы, необходимые для дифференцировки клеток. В качестве альтернативы группа Атала сосредоточилась на первичных клетках, предоставив доказательства, которые предполагают, что первичные клетки могут быть использованы для замены почечной функции человеческого размера, и они разработали метод, позволяющий эффективно размножать первичные клетки, которые могут поддерживать нормальный почечный фенотип (Abolbashari et al. al., 2016).

Кишечник

Децеллюляризация оказалась эффективным методом обеспечения бесклеточных кишечных каркасов с сохраненной нативной сосудистой сетью (Totonelli et al., 2012). Сохранение сосудистого доступа, такого как брыжеечная артерия и брыжеечная вена, облегчает трансплантацию органа, обеспечивая сосуды, которые могут быть анастомозированы в хозяине, обеспечивая немедленную перфузию в орган, необходимую для выживания трансплантата после трансплантации (Zhu et al., 2008 ).На сегодняшний день очень ограниченное количество работ посвящено сосудистой сети кишечника. Совсем недавно децеллюляризованные сегменты кишечника крыс были сконструированы с использованием эпителиальных клеток, полученных из ИПСК, в течение 14 дней и HUVEC в течение 3 дней. Затем кишечник имплантировали в гетеротопную модель, состоящую из подкожного трансплантата на шее, анастомозированного с сосудистой сетью и снабженного двухконцевыми стомами. Трансплантат выдерживали в течение 4 месяцев, результаты показали функциональность трансплантата, и питательные вещества, доставленные в просвет искусственно созданного кишечника через стому, адсорбировались в кровоток крысы.Однако проходимость сконструированных кровеносных сосудов напрямую не оценивалась (Kitano et al., 2017). Похожий подход был использован группой МакНила, которая вводила эндотелиальные клетки микрососудов кожи человека и фибробласты кожи человека в сосудистую сеть децеллюляризованного кишечника крысы. Они продемонстрировали успешную доставку и приживление клеток в децеллюляризованной сосудистой сети в дополнение к продолжающемуся ангиогенезу прорастания с участием DLL4-положительных клеток (Dew et al., 2016). На сегодняшний день появилось несколько сообщений, посвященных теме повторной эндотелиализации кишечника.Инженерия кишечной ткани изучается многими группами, но развитие сосудистой сети кишечника все еще остается открытой областью, заслуживающей внимания. Кишечный эпителий представляет собой сложную среду, в которой существует сложное перекрестное взаимодействие между многими различными типами клеток, поэтому важно будет раскрыть, как эпителий и эндотелий взаимодействуют в организации этого конкретного эпителия. Наконец, уместно отметить, что для достижения функционального кишечника необходима инженерия лимфатической ткани, и это только частично изучено (Koike et al., 2004).

Легкое

Функция легких зависит от наличия функциональной сосудистой сети для достижения оптимального газообмена. Поэтому неудивительно, что почти половина работы, связанной с инженерией всего легкого, сосредоточена на инженерии сосудистой сети. Ранние исследования продемонстрировали возможность децеллюляризации всего легкого (Maghsoudlou et al., 2013). Cortiella et al. сообщили о первой попытке децеллюляризации всего легкого. В этом исследовании они показали, как внеклеточный матрикс легких может инструктировать ЭСК мыши дифференцироваться в сайт-специфические клетки, такие как клетки CD31 +, аналогично тому, что наблюдалось в ЕСМ, полученных из других органов (Cortiella et al., 2010). Та же группа недавно сообщила о децеллюляризации детских легких человека с последующим посевом первичных эпителиальных и сосудистых клеток взрослого человека, а также о динамической культуре биореактора (Nichols et al., 2017). Интересно, что они сообщили о хорошем распределении клеток по каркасу с надлежащей рецеллюляризацией кровеносного сосуда. Присутствовали эпителий типа 1 и 2, и было показано, что он обладает способностью вырабатывать сурфактант.

В 2010 году команда Никласона децеллюляризовала легкие крысы и засеяла их легочным эпителием и эндотелием сосудов, используя изготовленный на заказ биореактор.Интересно, что засеянный эпителий демонстрирует замечательную иерархическую организацию внутри матрикса, а засеянные эндотелиальные клетки эффективно повторно заселяют сосудистый компартмент. Более того, механические характеристики сконструированных легких были аналогичны характеристикам нативной легочной ткани, и при имплантации крысам сконструированные легкие участвовали в газообмене (Petersen et al., 2010). Группа Отта имеет долгую историю работы над всей легочной инженерией; в 2014 году они сообщили о децеллюляризации легких крысы, свиньи и человека, а также о цитосовместимости этих матриц путем посева эпителиальных клеток или HUVEC на срезы (Gilpin et al., 2014). В последующем исследовании они представили концепцию воздействия как на эндотелиальный, так и на периваскулярный отделы и ввели посев как артериальным, так и венозным путями (Ren et al., 2015). Они совместно засевали либо HUVEC и hMSC, либо полученные из ИПСК ЭК и ПК, достигнув 75% эндотелиального покрытия, что привело к хорошей барьерной функции. Реэндотелиализированные легкие ортотопически трансплантировали крысам на 3 дня, in-vivo характеристика ограничивалась показом присутствия клеток и перфузии трансплантатов, засеянных HUVECs-hMSC.Наконец, в том же исследовании они показали масштабируемость до размера легких человека. Масштабируемость была улучшена в двух более поздних исследованиях, в которых та же группа показала рецеллюляризацию легких человека и свиньи как эпителиальными, так и эндотелиальными клетками (Gilpin et al., 2016; Zhou et al., 2017). Однако последние были ортотопически трансплантированы всего на 1 час, что показало плохую степень газообмена. В других опубликованных исследованиях удалось достичь равномерного клеточного распределения во всех децеллюляризованных легких крысы после посева с использованием эндотелиальных клеток микрососудов крысы (Calle et al., 2016; Stabler et al., 2016). Группа Никласона использовала концепцию регенерации фокального компартмента сосудов путем повторной эндотелизации децеллюляризированных легких крысы с использованием эндотелиальных клеток крыс, поддерживаемых стволовыми / стромальными клетками, полученными из жировой ткани крыс, которые дали начало перицитам. Повторно эндотелиализированные легкие показали улучшенное сосудистое сопротивление, сопоставимое с нативными легкими, кроме того, они были ортотопически трансплантированы крысам в течение 3 часов, показывая, как присутствие периваскулярных клеток предотвращает образование отека (Doi et al., 2017).

Наконец, Вагнер и др. Предложили несколько иной подход. (2014). В своем исследовании они выделили бронховаскулярные пучки и покрыли их альгинатом натрия, показывая, как это увеличивает клеточную адгезию в сторону увеличения, однако они сообщают о вариабельности результатов децеллюляризации, которые не удалось стандартизировать. Взятые вместе исследования, сфокусированные на легких, показывают, что посев через артериальные и сосудистые сосуды необходим для достижения равномерного распределения клеток, которые потенциально могут поддерживать функцию органа.Результаты обнадеживают, однако при повторной эндотелизации легких по-прежнему отсутствуют результатов трансплантации in vivo , которые превышают 3 дня.

Сердце

В контексте сердца эндотелиальные клетки играют двойную роль: они выстилают коронарную сосудистую сеть, обеспечивают питательными веществами сердечную мышцу, а также покрывают клапаны и камеры сердца. Команда Тейлора впервые исследовала реэндотелизацию всего сердца на крысах. Эндотелиальные клетки аорты крысы высевали на децеллюляризованные сердца крыс посредством перфузии аорты.После 1 недели динамического культивирования в биореакторе клетки повторно заселили коронарные сосуды и показали метаболическую активность (Ott et al., 2008). Похожий подход был описан Yasui et al. которые сообщили о 30-дневном успешном динамическом совместном культивировании, когда каркасы были засеяны неонатальными эндотелиальными клетками крыс наряду с неонатальными кардиомиоцитами и фибробластами крыс. Эти результаты показали, что, хотя они и достигают сокращения, клетки случайным образом распределяются в ECM органа (Yasui et al., 2014). С методологической точки зрения, в других исследованиях сравнивались разные подходы к посеву.Робертсон и др. продемонстрировали, что когда эндотелиальные клетки аорты крысы высевают на децеллюляризованное сердце крысы, лучшее распределение клеток достигается, когда перфузия осуществляется через нижнюю полую вену и брахиоцефальную артерию по сравнению с аортой. Было показано, что через 7 дней культуральные клетки биореактора сохраняют свой фенотип, способны продуцировать оксид азота и снижают тромбоз в анализе in vitro . Наконец, они выполнили гетеротопическую трансплантацию анастомозом к аорте и нижней полой вене реципиента, трансплантируя незасеянные каркасы в качестве контроля.Через 1 неделю в повторно эндотелиализированных сердцах обнаружилось образование прозрачных сосудов с пониженной частотой свертывания крови (Robertson et al., 2014).

Расширение масштабов методов было описано в двух исследованиях с использованием сердец свиньи и человека. Weymann et al. высевали HUVEC и неонатальные кардиальные клетки мыши на децеллюляризованный каркас сердца свиньи и культивировали орган в биореакторе в течение 3 недель. Через 10 дней сообщалось об однородной реэндотелизации коронарного тракта (Weymann et al., 2014). Sanchez et al. сообщили о децеллюляризации всего сердца человека (Sánchez et al., 2015) с последующей рецеллюляризацией срезов ткани. Рецеллюляризацию тестировали путем культивирования HUVEC с разными типами клеток на срезах каркаса в течение 21 дня. Сообщалось о миграции эндотелиальных клеток, и было показано, что клетки выстилают эндокард и сосудистую сеть, что еще раз демонстрирует, что ECM может направлять клетки в их правильное местоположение во время приживления. Чтобы успешно спроектировать все необходимое для клинического перевода, необходимо расширять масштабы техник.На сегодняшний день исследования ограничиваются использованием HUVEC и клеток аорты крысы, что делает необходимым поиск более подходящего первичного источника клеток, особенно потому, что эндотелий необходим также для предсердий, желудочков и клапанов. Ортотопическая инженерия сердца представляет собой невероятные проблемы, гетеротипные имплантаты в дополнение к надлежащей функциональной оценке in vitro сконструированной сосудистой сети необходимы для перехода к следующему этапу.

Обсуждение и будущие направления

На сегодняшний день существует значительный интерес к области тканевой инженерии целого органа.Растущий спрос на решение проблемы доступности органов для трансплантации стоит на повестке дня пациентов, врачей и медицинских работников. Целостная органная инженерия — это инновационная и захватывающая область исследований, в которой есть потенциал преодоления и решения проблемы доступности трансплантируемых органов. Есть некоторые органы и ткани, для которых сосудистая сеть не играет заметной роли, о чем свидетельствует успешная трансплантация искусственно сконструированных трахей, которые были поддержаны сальниковым обертыванием при ортотопической трансплантации (Elliott et al., 2012). Однако, как обсуждалось выше, очевидно, что сосудистая сеть является фундаментальной особенностью более сложных органов.

Большинство текущих исследований в области тканевой инженерии целых органов используют децеллюляризованные органы в качестве основы, обеспечивая основу, на которой может быть построен сложный многоклеточный орган. Это неудивительно, поскольку на сегодняшний день ни один другой метод производства не может предоставить каркас, который может воспроизводить сложную структуру и анатомию человеческого органа.Можно предположить, что в ближайшем будущем инновации в технологиях производства, такие как 3D-печать или стереолитография, смогут создавать сложные структуры с использованием биоактивных материалов. В самом деле, достижения в области трехмерной биопечати могут напрямую принести пользу области тканевой инженерии, позволяя напрямую печатать клетки на каркасе.

Тем не менее, современные методы децеллюляризации способны сохранить архитектуру целых органов, особенно сосудистой сети, что приводит к возможности доставки эндотелиальных клеток напрямую через перфузию, что позволяет создать сосудистую сеть, аналогичную первичному органу.

В отличие от синтетического каркаса, каркасы природного происхождения поддерживают внеклеточный матрикс, который, как было показано, оказывает положительное влияние на посев клеток, способствуя приживлению клеток, миграции и дифференцировке. Эта функция ECM была продемонстрирована различными группами по всему миру и представляет собой один из самых мощных инструментов в руках исследователей. В настоящее время мы не полностью понимаем биохимические и топологические сигналы, которые управляют этим процессом, однако клетки могут быть организованы и перемещены в нужное место даже в сложных и очень тканеспецифичных участках.С методологической точки зрения, используя эту особенность внеклеточного матрикса, исследователи могут доставлять разные популяции клеток к децеллюляризованному каркасу одновременно, полагаясь на самоорганизацию.

Основным препятствием на пути тканевой инженерии сложных многоклеточных органов является культуральная среда. Для разных типов клеток требуются разные биохимические среды и стимулы, поэтому определение культуральной среды, которая хорошо переносится различными клетками разного происхождения, не влияя на пути дифференцировки, представляет собой серьезную проблему.

Помимо биохимических и топологических сигналов, динамическая среда играет решающую роль в тканевой инженерии, что демонстрируется преимуществом, обеспечиваемым динамическим культивированием на основе биореактора. Это особенно важно для сосудистой сети, и необходимо обеспечить перфузию для создания кровеносных сосудов. Эндотелиальные клетки сильно выигрывают от напряжения сдвига, чтобы расти и выражать правильный фенотип. Расчет величины напряжения сдвига в сложной сети кровеносных сосудов, такой как сеть целых органов, является сложной задачей.Благоприятный эффект перфузии очевиден, по крайней мере, с точки зрения обеспечения равномерного распределения питательных веществ. Сложные вычислительные модели в сочетании с отслеживанием частиц могут быть применены к этому полю, чтобы точно настроить величину напряжения сдвига, которому должны подвергаться эндотелиальные клетки. Более того, обеспечение динамической перфузии позволяет избежать образования скоплений клеток во время культивирования.

В совокупности рассмотренные здесь исследования содержат большой потенциал, который требует дальнейшего использования и расширения.Однако все еще существует значительный пробел на пути к реальному клиническому воплощению искусственно созданных реваскуляризованных органов. Многие исследования на сегодняшний день используют только один путь сосудистого доступа и не исследуют, рецеллюляризованы и венозная, и артериальная сети. Несколько групп, которые использовали инфузию клеток как через артериальный, так и через сосудистый доступ, показали более однородное распределение клеток по каркасу, и для авторов это выглядит как путь, которым следует следовать в будущих стратегиях посева.Помимо посева клеток, никакие исследования не продемонстрировали способность долговременной перфузии на ортотопических моделях, текущие исследования сообщают о коротких временных точках, ограниченных несколькими часами или днями, в основном из-за свертывания крови. Кроме того, исследования должны быть сосредоточены на предоставлении надежных и воспроизводимых методов оценки функции сосудистой сети и проходимости. Следует использовать активные методы, которые показывают перфузию органа, и оценивать проходимость in vivo . На сегодняшний день ни в одном исследовании не удалось достичь полностью сливного регенерированного эндотелия, и это остается серьезным препятствием для демонстрации функциональности, напоминающей нормальное физиологическое состояние.

Чтобы достичь долгосрочной проходимости сети кровеносных сосудов, исследователи должны сосредоточиться на доставке ex-vivo , стабильной и функциональной сосудистой сети, которая обеспечивает адекватный и сливной эндотелиальный слой. Исследования были затруднены из-за наличия клинически значимых источников эндотелиальных клеток. Почти в большинстве исследований, представленных в этом обзоре, используются HUVEC, но взрослые эндотелиальные клетки обладают ограниченным пролиферативным потенциалом и нестабильны в течение длительного периода времени (Таблица 1).Это в значительной степени ограничивает применение нормальных взрослых клеток для тканей человеческого размера. ИПСК могут быть мощной альтернативой, но ограничены текущими проблемами безопасности и трудностями в достижении функциональной, стабильной и однородной дифференциации. Напротив, прямое перепрограммирование взрослых клеток с использованием преимуществ экспрессии факторов плода имеет большой потенциал с меньшими процедурными проблемами. Как было подчеркнуто, периваскулярные клетки играют фундаментальную роль в развитии и стабилизации сосудистой сети.Учитывая, что надежные и неинвазивные источники периваскулярных клеток, такие как мезоангиобласты, доступны, исследования тканевой инженерии должны прилагать усилия к разработке стратегий, которые используют преимущества использования периваскулярных клеток для поддержки эндотелиальных клеток.

Таблица 1 . Резюме исследований, представленных в обзоре, посвященных реваскуляризации целых органов.

В заключение, области тканевой инженерии целого органа достигли момента расширения масштабов для разработки функциональных доклинических моделей, рассчитанных на человека.Васкуляризация будет краеугольным камнем, необходимым для создания полностью функциональных, тканевых органов, которые выживут и будут функционировать после трансплантации.

Авторские взносы

AFP, AMT и PDC внесли свой вклад в разработку концепции и написание статьи.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

PDC поддерживается NIHR Professorship RP 2014-04-046; AFP финансируется за счет гранта INTENS h3020 668294; AMT поддерживается GSK-BBSRC iCASE Studenthip, мы благодарим доктора Джемму Молинье за ​​критический обзор рукописи.

Список литературы

Abolbashari, M., Agcaoili, S.M., Lee, M.K., Ko, I.K., Aboushwareb, T., Jackson, J.D., et al. (2016). Репопуляция каркаса почек свиньи с использованием первичных почечных клеток свиней. Acta Biomater. 29, 52–61. DOI: 10.1016 / j.actbio.2015.11.026

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Армулик, А., Дженов, Г., Бетсхольц, К. (2011). Перициты: перспективы развития, физиологические и патологические, проблемы и перспективы. Dev. Cell 21, 193–215. DOI: 10.1016 / j.devcel.2011.07.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст

Асахара Т., Мурохара Т., Салливан А., Сильвер М., ван дер Зи Р., Ли Т. и др.(1997). Выделение предполагаемых эндотелиальных клеток-предшественников для ангиогенеза. Science 275, 964–967. DOI: 10.1126 / science.275.5302.964

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бадилак, С.Ф., Тейлор, Д., и Уйгун, К. (2011). Инженерия тканей всего органа: децеллюляризация и рецеллюляризация трехмерных матричных каркасов. Annu. Преподобный Биомед. Англ. 13, 27–53. DOI: 10.1146 / annurev-bioeng-071910-124743

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст

Бао, Дж., Wu, Q., Sun, J., Zhou, Y.J., Wang, Y.J., Jiang, X., et al. (2015). Улучшение гемосовместимости перфузионно-децеллюляризованного каркаса печени клинического масштаба посредством иммобилизации гепарина. Sci. Реп . 5: 10756. DOI: 10.1038 / srep10756

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Баптиста П. М., Сиддики М. М., Лозье Г., Родригес С. Р., Атала А. и Сокер С. (2011). Использование децеллюляризации всего органа для создания васкуляризованного органоида печени. Гепатология 53, 604–617. DOI: 10.1002 / hep.24067

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Батчелдер, К. А., Мартинес, М. Л., и Таранталь, А. Ф. (2015). Природные каркасы для почечной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека для тканевой инженерии почек. PLoS ONE 10: e0143849. DOI: 10.1371 / journal.pone.0143849

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бомбелли, С., Мерегалли, К., Скалиа, К., Бово, Г., Торселло, Б., Де Марко, С. (2017). Клетки, происходящие из нефросферы, индуцируются к многолинейной дифференцировке при культивировании на децеллюляризованных каркасах почек человека. г. J. Pathol. 188, 184–195. DOI: 10.1016 / j.ajpath.2017.09.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бонандрини Б., Фиглиуцци М., Пападиму Э., Мориджи М., Перико Н., Казираги Ф. и др. (2014). Рекеллюляризация хорошо сохранившегося бесклеточного каркаса почек с использованием эмбриональных стволовых клеток. Tissue Eng. Часть A 20, 1486–1498. DOI: 10.1089 / ten.tea.2013.0269

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бурк, Б. М., Рош, В. Р., и Эпплберг, М. (1986). Сбор эндотелиальных клеток для посева сосудистых протезов — влияние техники на функцию, жизнеспособность и количество клеток. J. Vasc. Surg. 4, 257–263. DOI: 10.1016 / 0741-5214 (86)

-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Батлер, Дж.М., Кобаяши, Х., Рафии, С. (2010). Поучительная роль сосудистой ниши в стимулировании роста опухоли и восстановления тканей ангиокринными факторами. Нат. Rev. Cancer 10, 138–146. DOI: 10.1038 / nrc2791

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Calle, E. A., Hill, R. C., Leiby, K. L., Le, A. V., Gard, A. L., Madri, J. A., et al. (2016). Нацеленная протеомика эффективно определяет различия между нативным легким и внеклеточным матриксом легкого, децеллюляризованным детергентом. Acta Biomater. 46, 91–100. DOI: 10.1016 / j.actbio.2016.09.043

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Cortiella, J., Niles, J., Cantu, A., Brettler, A., Pham, A., Vargas, G., et al. (2010). Влияние бесклеточного естественного матрикса легких на дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши и формирование ткани. Tissue Eng. Часть A 16, 2565–2580. DOI: 10.1089 / ten.tea.2009.0730

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Коссу, Г., Бирчалл, М., Браун, Т., Де Коппи, П., Калм-Сеймур, Э., Гиббон, С. и др. (2017). Ланцетная комиссия: стволовые клетки и регенеративная медицина. Ланцет 391, 883–910. DOI: 10.1016 / S0140-6736 (17) 31366-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Коссу, Г., Превитали, С. К., Наполитано, С., Чикалезе, М. П., Тедеско, Ф. С., Никастро, Ф. и др. (2015). Внутриартериальная трансплантация HLA-согласованных донорских мезоангиобластов при мышечной дистрофии Дюшенна. EMBO Mol. Med. 7, 1513–1528. DOI: 10.15252 / emmm.201505636

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Крапо П. М., Гилберт Т. В. и Бадилак С. Ф. (2011). Обзор процессов децеллюляризации тканей и всего органа. Биоматериалы 32, 3233–3243. DOI: 10.1016 / j.biomaterials.2011.01.057

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Деллавалле, А., Мароли, Г., Коварелло, Д., Аззони, Э., Инночензи, А., Перани, Л. и др. (2011). Перициты, находящиеся в постнатальных скелетных мышцах, дифференцируются в мышечные волокна и генерируют сателлитные клетки. Нат. Commun. 2: e50532. DOI: 10.1038 / ncomms1508

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Деллавалле, А., Сампаолези, М., Тонлоренци, Р., Тальяфико, Э., Саккетти, Б., Перани, Л. и др. (2007). Перициты скелетных мышц человека являются миогенными предшественниками, отличными от сателлитных клеток. Нат. Cell Biol. 9, 255–267. DOI: 10.1038 / ncb1542

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дью, Л., Инглиш, У. Р., Чонг, К. К., и МакНил, С. (2016). Изучение неоваскуляризации в децеллюляризованном кишечнике крысы: платформа in vitro для изучения ангиогенеза. Tissue Eng. Часть A 22, 1317–1326. DOI: 10.1089 / ten.tea.2016.0131

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Диас-Флорес, Л., Гутьеррес, Р., Madrid, J. F., Varela, H., Valladares, F., Acosta, E., et al. (2009). Перициты. морфофункция, взаимодействия и патология в нише покоящихся и активированных мезенхимальных клеток. Histol. Histopathol. 24, 909–969. DOI: 10.14670 / HH-24.909

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Динг Б. С., Нолан Д. Дж., Батлер Дж. М., Джеймс Д., Бабазаде А. О., Розенвакс З. и др. (2010). Индуктивные ангиокринные сигналы от синусоидального эндотелия необходимы для регенерации печени. Nature 468, 310 – U240. DOI: 10.1038 / nature09493

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дин Б. С., Нолан Д. Дж., Го П. П., Бабазаде А. О., Цао З. У., Розенвакс З. и др. (2011). Ангиокринные сигналы эндотелиального происхождения вызывают и поддерживают регенеративную альвеоляризацию легких. Ячейка 147, 539–553. DOI: 10.1016 / j.cell.2011.10.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дои Р., Цучия Т., Мицутаке, Н., Нисимура, С., Мацуу-Мацуяма, М., Накадзава, Ю. и др. (2017). Трансплантация биоинженерных легких крыс, рецеллюляризованных эндотелиальными и полученными из жировой ткани стромальными клетками. Sci. Реп. 7: 8447. DOI: 10.1038 / s41598-017-09115-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Du, C., Narayanan, K., Leong, M. F., Ibrahim, M. S., Chua, Y. P., Khoo, V. M., et al. (2016). Функциональная биоинженерия почек с использованием плюрипотентных стволовых клеток почечных клеток-предшественников и децеллюляризованных каркасов почек. Adv. Здоровьеc. Матер. 5, 2080–2091. DOI: 10.1002 / adhm.201600120

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эллиотт, М. Дж., Де Коппи, П., Спеджиорин, С., Робак, Д., Батлер, К. Р., Самуэль, Э. и др. (2012). Тканево-инженерное замещение трахеи у ребенка на основе стволовых клеток: последующее исследование через 2 года. Ланцет 380, 994–1000. DOI: 10.1016 / S0140-6736 (12) 60737-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фишман, Дж.M., Lowdell, M. W., Urbani, L., Ansari, T., Burns, A.J., Turmaine, M., et al. (2013). Иммуномодулирующий эффект децеллюляризованного каркаса скелетных мышц в дискордантной модели ксенотрансплантации. Proc. Natl. Акад. Sci. США 110, 14360–14365. DOI: 10.1073 / pnas.1213228110

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Герли М. Ф., Маффиолетти С. М., Миллет К. и Тедеско Ф. С. (2014). Трансплантация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток мезоангиобластоподобных миогенных предшественников на мышиных моделях мышечной регенерации. J. Vis. Exp. 20: e50532. DOI: 10.3791 / 50532

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Герли, М. Ф. М., Гайетт, Дж. П., Евангелиста-Лейте, Д., Гошхаджра, Б. Б. и Отт, Х. С. (2018). Перфузионная децеллюляризация конечности человека: новая платформа для композитной тканевой инженерии и реконструктивной хирургии. PLoS ONE 13: e01. DOI: 10.1371 / journal.pone.01

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гилпин, А., и Ян, Ю. (2017). Стратегии децеллюляризации в регенеративной медицине: от методов обработки до приложений. Biomed Res. Int. 2017: 9831534. DOI: 10.1155 / 2017/9831534

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гилпин, С. Э., Чарест, Дж. М., Рен, X., Тапиас, Л. Ф., Ву, Т., Евангелиста-Лейте, Д. и др. (2016). Регенеративный потенциал стволовых клеток дыхательных путей человека в эпителиальной инженерии легких. Биоматериалы 108, 111–119.DOI: 10.1016 / j.biomaterials.2016.08.055

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гилпин, С. Э., Гайетт, Дж. П., Гонсалес, Г., Рен, X., Асара, Дж. М., Матисен, Д. Дж. И др. (2014). Перфузионная децеллюляризация легких человека и свиньи: доведение матрицы до клинического масштаба. J. Heart Lung. Пересадка. 33, 298–308. DOI: 10.1016 / j.healun.2013.10.030

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гинзберг, М., Шахтерле В., Шидо К. и Рафии С. (2015). Прямое преобразование амниотических клеток человека в эндотелиальные клетки без перехода через плюрипотентное состояние. Нат. Protoc. 10, 1975–1985. DOI: 10.1038 / nprot.2015.126

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Го Ю., Ву К., Сюй Л., Сюй Ю., Сяохун Л. и Хуэй З. (2018). Васкуляризация децеллюляризованного каркаса поджелудочной железы эндотелиальными клетками-предшественниками. J. Artif. Органы .DOI: 10.1007 / s10047-018-1017-6. [Epub перед печатью].

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гамильтон, Д. В., Мол, Т. М., и Ворп, Д. А. (2004). Характеристика реакции клеток-предшественников костного мозга на циклическую деформацию: значение для приложений тканевой инженерии сосудов. Tissue Eng. 10, 361–369. DOI: 10.1089 / 107632704323061726

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ханнан, Н.Р., Сегериц, К. П., Тубуль, Т., и Валлиер, Л. (2013). Производство гепатоцитоподобных клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека. Нат. Protoc. 8, 430–437. DOI: 10.1038 / nprot.2012.153

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Харрис, Л. Дж., Абдоллахи, Х., Чжан, П., Макилхенни, С., Туленко, Т. Н., и ДиМузио, П. Дж. (2011). Дифференциация взрослых стволовых клеток в гладкие мышцы для тканевой инженерии сосудов. J. Surg. Res. 168, 306–314.DOI: 10.1016 / j.jss.2009.08.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хе Х., Широта Т., Ясуи Х. и Мацуда Т. (2003). Гибридный сосудистый трансплантат, покрытый эндотелиальными клетками-предшественниками собак, с нетромбогенным потенциалом. J. Thorac. Кардиов. Surg. 126, 455–464. DOI: 10.1016 / S0022-5223 (02) 73264-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ху, Дж., Шривастава, К., Виланд, М., Рунге, А., Моглер, К., Бесемфельдер, Э., и другие. (2014). Ангиопоэтин-2, полученный из эндотелиальных клеток, контролирует регенерацию печени как пространственно-временной реостат. Наука 343, 416–419. DOI: 10.1126 / science.1244880

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хусейн К. Х., Парк К. М., Канг К. С. и Ву Х. М. (2016). Гепарин-желатиновая смесь улучшает эффективность реконструкции сосудов и функцию печени в печени, полученной методом биоинженерии. Acta Biomater. 38, 82–93. DOI: 10.1016 / j.actbio.2016.04.042

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джайн, Р. К., Ау, П., Там, Дж., Дуда, Д. Г., и Фукумура, Д. (2005). Инженерия васкуляризированной ткани. Нат. Biotechnol. 23, 821–823. DOI: 10.1038 / nbt0705-821

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Юнг, Ю., Джи, Х.Й., Чен, З.З., Чан, Х.Ф., Атчисон, Л., Клитцман, Б., и др. (2015). Кровеносные сосуды, созданные на основе ткани, не содержащей каркаса, на основе мезенхимальных стволовых клеток человека. Sci. Реп. 5: 15116. DOI: 10.1038 / srep15116

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кадота Ю., Яги Х., Иномата К., Мацубара К., Хиби Т., Абэ Ю. и др. (2014). Мезенхимальные стволовые клетки поддерживают функцию гепатоцитов в модифицированных трансплантатах печени. Органогенез 10, 268–277. DOI: 10.4161 / org.27879

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Китано, К., Шварц, Д. М., Чжоу, Х. Ю., Гилпин, С.E., Wojtkiewicz, G.R., Ren, X., et al. (2017). Биоинженерия функциональных кишечных трансплантатов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, индуцированных человеком. Нат. Commun. 8: 765. DOI: 10.1038 / s41467-017-00779-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ко, И. К., Пенг, Л., Пелосо, А., Смит, К. Дж., Дхал, А., Диган, Д. Б. и др. (2015). Биоинженерная трансплантируемая свиная печень с повторно эндотелиализированной сосудистой сетью. Биоматериалы 40, 72–79. DOI: 10.1016 / j.biomaterials.2014.11.027

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Коике, Н., Фукумура, Д., Гралла, О., Ау, П., Шехнер, Дж. С., и Джайн, Р. К. (2004). Тканевая инженерия: создание долговечных кровеносных сосудов. Природа 428, 138–139. DOI: 10.1038 / 428138a

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ковачич, Дж. К., и Бём, М. (2009). Резидентные сосудистые клетки-предшественники: возрастающая роль нетерминально дифференцированных резидентных клеток сосудов в биологии сосудов. Stem Cell Res. 2, 2–15. DOI: 10.1016 / j.scr.2008.05.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Leclerc, E., Kimura, K., Shinohara, M., Danoy, M., Le Gall, M., Kido, T., et al. (2017). Сравнение транскриптомного профиля индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток печени, культивируемых в чашках и в динамической среде трехмерного микромасштаба. Genomics 109, 16–26. DOI: 10.1016 / j.ygeno.2016.11.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лорвеллек, М., Скоттони, Ф., Кроули, К., Фиадейро, Р., Магсудлоу, П., и Пеллегата, А. Ф. (2017). Децеллюляризованный каркас печени мыши улучшает дифференцировку эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в гепатоцитоподобные клетки. PLoS ONE 12: e0189586. DOI: 10.1371 / journal.pone.0189586

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Maghsoudlou, P., Georgiades, F., Smith, H., Milan, A., Shangaris, P., Urbani, L., et al. (2016). Оптимизация децеллюляризации печени поддерживает микроархитектуру и состав внеклеточного матрикса, предрасполагающие к эффективному посеву клеток. PLoS ONE 11: e0155324. DOI: 10.1371 / journal.pone.0155324

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Maghsoudlou, P., Georgiades, F., Tyraskis, A., Totonelli, G., Loukogeorgakis, S.P., Orlando, G., et al. (2013). Сохранение микроархитектуры и ангиогенного потенциала в бесклеточном матриксе легких, полученное с помощью прерывистого интратрахеального потока детергентной ферментативной обработки. Биоматериалы 34, 6638–6648. DOI: 10.1016 / j. биоматериалы.2013.05.015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Майка, С. М., Джексон, К. А., Киенстра, К. А., Майески, М. В., Гуделл, М. А., и Хирши, К. К. (2003). Определенные популяции предшественников в скелетных мышцах происходят из костного мозга и демонстрируют разные клеточные судьбы во время регенерации сосудов. J. Clin. Инвестировать. 111, 71–79. DOI: 10.1172 / JCI16157

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мацца, Г., Ромбоут, К., Холл А. Р., Урбани Л., Луонг Т. В., Аль-Аккад В. и др. (2015). Децеллюляризованная печень человека как естественный 3D-каркас для биоинженерии и трансплантации печени. Sci Rep. 5: 13079. DOI: 10.1038 / srep13079

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Миллер Ф. Н. и Симс Д. Э. (1986). Сократительные элементы в регуляции проницаемости макромолекул. FASEB J. 45, 84–88.

PubMed Аннотация

Минаси, М.G., Riminucci, M., De Angelis, L., Borello, U., Berarducci, B., Innocenzi, A., et al. (2002). Мезо-ангиобласт: мультипотентная, самообновляющаяся клетка, которая происходит из дорсальной аорты и дифференцируется в большинство мезодермальных тканей. Развитие 129, 2773–2784.

PubMed Аннотация

Нефф, Л. П., Тиллман, Б. В., Яздани, С. К., Мачингал, М. А., Ю, Дж. Дж., Сокер, С., и др. (2011). Гладкие мышцы сосудов усиливают функциональность тканевых кровеносных сосудов in vivo . J. Vasc. Surg. 53, 426–434. DOI: 10.1016 / j.jvs.2010.07.054

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Николс, Дж. Э., Ла Франческа, С., Вега, С. П., Найлс, Дж. А., Аргуета, Л. Б., Риддл, М. и др. (2017). Давать новую жизнь старым легким: методы производства и оценки целых детских биоинженерных легких человека. J. Tissue Eng. Regen. Med. 11, 2136–2152. DOI: 10.1002 / term.2113

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нолан, Д.J., Ginsberg, M., Israely, E., Palikuqi, B., Poulos, M. G., James, D., et al. (2013). Молекулярные признаки тканеспецифической гетерогенности эндотелиальных клеток микрососудов в поддержании и регенерации органов. Dev. Cell 26, 204–219. DOI: 10.1016 / j.devcel.2013.06.017

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Олсон, Л. Э., и Сориано, П. (2011). Передача сигналов PDGFR beta регулирует пластичность настенных клеток и подавляет образование жира. Dev. Cell 20, 815–826.DOI: 10.1016 / j.devcel.2011.04.019

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Орландо Г., Вуд К. Дж., Де Коппи П., Баптиста П. М., Биндер К. В., Битар К. Н. и др. (2012). Восстановительная медицина применительно к общей хирургии. Ann. Surg. 255, 867–880. DOI: 10.1097 / SLA.0b013e318243a4db

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Орлова В. В., ван ден Хиль, Ф. Э., Петрус-Реурер, С., Драбш, Ю., тен Дийке, П., и Маммери, К.Л. (2014). Создание, распространение и функциональный анализ эндотелиальных клеток и перицитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека. Нат. Protoc. 9, 1514–1531. DOI: 10.1038 / nprot.2014.102

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Отани А., Киндер К., Эвальт К., Отеро Ф. Дж., Шиммель П. и Фридлендер М. (2002). Стволовые клетки костного мозга нацелены на астроциты сетчатки и могут стимулировать или ингибировать ангиогенез сетчатки. Нат. Med. 8, 1004–1010. DOI: 10,1038 / нм744

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Отт, Х. К., Маттиесен, Т. С., Гох, С. К., Блэк, Л. Д., Крен, С. М., Нетофф, Т. И., и др. (2008). Перфузионно-децеллюляризованная матрица: использование платформы природы для создания биоискусственного сердца. Нат. Med. 14, 213–221. DOI: 10,1038 / нм1684

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пеллегата, А. Ф., Доминиони, Т., Балло, Ф., Маэстрони, С., Аснаги, М.A., Zerbini, G., et al. (2015). Артериальные децеллюляризованные каркасы производятся с использованием инновационной автоматической системы. Клетки Тканевые органы 200, 363–373. DOI: 10.1159 / 000439082

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пелосо А., Петросян А., Да Сакко С., Бут К., Замбон Дж. П., О’Брайен Т. и др. (2015). Каркасы внеклеточного матрикса почек из выброшенных почек поддерживают морфометрию клубочков и эластичность сосудов, а также сохраняют критические факторы роста. Трансплантация 99, 1807–1816. DOI: 10.1097 / T.P.0000000000000811

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Peloso, A., Urbani, L., Cravedi, P., Katari, R., Maghsoudlou, P., Fallas, M. E., et al. (2016). Поджелудочная железа человека как источник протолерогенного внеклеточного матрикса для биоискусственной эндокринной поджелудочной железы нового поколения. Ann. Surg. 264, 169–179. DOI: 10.1097 / SLA.0000000000001364

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Петерсен, Т.Х., Калле, Э. А., Чжао, Л. П., Ли, Э. Дж., Гуи, Л. К., Раредон, М. Б. и др. (2010). Легкие с тканевой инженерией для имплантации in vivo . Наука 329, 538–541. DOI: 10.1126 / science.1189345

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Поулос М.Г., Кроули М.Дж.П., Гуткин М.С., Рамалингам П., Шахтерле В. и др. (2015). Сосудистая платформа для определения факторов гемопоэтических стволовых клеток и усиления регенеративного кроветворения. Stem Cell Rep. 5, 881–894. DOI: 10.1016 / j.stemcr.2015.08.018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рамасами, С. К., Кусумбе, А. П., и Адамс, Р. Х. (2015). Регуляция морфогенеза тканей с помощью сигналов эндотелиальных клеток. Trends Cell Biol. 25, 148–157. DOI: 10.1016 / j.tcb.2014.11.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рен, X., Мозер, П. Т., Гилпин, С. Э., Окамото, Т., Ву, Т., Тапиас, Л. Ф., и другие. (2015). Инженерная легочная сосудистая сеть в децеллюляризованных легких крыс и человека. Нат. Biotechnol. 33, 1097–1102. DOI: 10.1038 / NBT.3354

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Робертсон, М. Дж., Дрис-Девлин, Дж. Л., Крен, С. М., Берчфилд, Дж. С., и Тейлор, Д. А. (2014). Оптимизация рецеллюляризации всего децеллюляризованного внеклеточного матрикса сердца. PLoS ONE 9: e. DOI: 10.1371 / journal.pone.00

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Rouget, C.(1874 г.). Обратите внимание на развитие сократительной оболочки вайссо. Compt. Rend Acad. Sci. 59, 559–562.

Саккетти Б., Фунари А., Ремоли К., Джанникола Г., Коглер Г., Лидтке С. и др. (2016). Не существует идентичных «мезенхимальных стволовых клеток» в разное время и в разных местах: коммитированные предшественники человека с разным происхождением и дифференцированным потенциалом включаются в микрососуды как адвентициальные клетки. Stem Cell Rep. 6, 897–913. DOI: 10.1016 / j.stemcr.2016.05.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Санчес П. Л., Фернандес-Сантос М. Э., Костанца С., Климент А. М., Москосо И., Гонсалес-Николас М. А. и др. (2015). Бесклеточный матрикс сердца человека: важный шаг на пути к цельносердечным трансплантатам. Биоматериалы 61, 279–289. DOI: 10.1016 / j.biomaterials.2015.04.056

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Скарритт М. Э., Пашос Н. К. и Баннелл Б. А.(2015). Обзор стратегий клеточности для тканевой инженерии целых органов. Фронт. Bioeng. Biotechnol. 30, 43. DOI: 10.3389 / fbioe.2015.00043

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шмидт Д., Брейманн К., Вебер А., Гюнтер К. И., Нойеншвандер С., Зунд Г. и др. (2004). Эндотелиальные клетки-предшественники, полученные из пуповинной крови, для тканевой инженерии сосудистых трансплантатов. Ann. Грудной. Surg. 78, 2094–2098. DOI: 10.1016 / j.athoracsur.2004.06.052

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Shi, Q., Rafii, S., Wu, M.H., Wijelath, E. S., Yu, C., Ishida, A., et al. (1998). Доказательства циркуляции эндотелиальных клеток костного мозга. Кровь 92, 362–367.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Сиракигава, Н., Такей, Т., и Идзима, Х. (2013). Базовая структура, состоящая из эндотелиализированной сети сосудистого дерева и гепатоцитов для инженерии всей печени. J. Biosci. Bioeng. 116, 740–745. DOI: 10.1016 / j.jbiosc.2013.05.020

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Широта Т., Хе Х. Б., Ясуи Х. и Мацуда Т. (2003). Гибридный трансплантат, засеянный эндотелиальными клетками-предшественниками человека: пролиферативный и антитромбогенный потенциалы in vitro и производственная обработка. Tissue Eng. 9, 127–136. DOI: 10.1089 / 107632703762687609

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сонг, Дж.Дж., Гайетт, Дж. П., Гилпин, С. Э., Гонсалес, Г., Ваканти, Дж. П. и Отт, Х. С. (2013). Регенерация и экспериментальная ортотопическая трансплантация биоинженерной почки. Нат. Med. 19, 646–651. DOI: 10,1038 / нм. 3154

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Stabler, C. T., Caires, L. C., Mondrinos, M. J., Marcinkiewicz, C., Lazarovici, P., Wolfson, M. R., et al. (2016). Усиленная реэндотелизация децеллюляризованных легких крыс. Tissue Eng.Часть C Методы 22, 439–450. DOI: 10.1089 / ten.tec.2016.0012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сайедайн, З. Х., Грэм, М. Л., Данн, Т. Б., О’Брайен, Т., Джонсон, С. Л., Шумахер, Р. Дж. И др. (2017). Полностью биологический «готовый» артериовенозный трансплантат, рецеллюляризующийся у бабуинов. Sci. Пер. Med. 9: eaan4209. DOI: 10.1126 / scitranslmed.aan4209

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тальяфико, Э., Brunelli, S., Bergamaschi, A., De Angelis, L., Scardigli, R., Galli, D., et al. (2004). TGF бета / BMP активируют программы дифференцировки гладких мышц / костей в мезоангиобластах. J. Cell Sci. 117, 4377–4388. DOI: 10.1242 / jcs.01291

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Takebe, T., Koike, N., Sekine, K., Fujiwara, R., Amiya, T., Zheng, Y. W., et al. (2014). Инженерия ткани печени человека с функциональными сосудистыми сетями. Органогенез 10, 260–267.DOI: 10.4161 / org.27590

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Takebe, T., Sekine, K., Enomura, M., Koike, H., Kimura, M., Ogaeri, T., et al. (2013). Васкуляризованная и функциональная печень человека после трансплантации зачатка органа, полученного из ИПСК. Природа 499, 481–484. DOI: 10.1038 / nature12271

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Такимото Ю., Диксит В., Артур М. и Гитник Г. (2003). Формирование ткани печени de novo у крыс с использованием нового коллаген-полипропиленового каркаса. Пересадка клеток. 12, 413–421. DOI: 10.3727 / 000000003108746966

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Totonelli, G., Maghsoudlou, P., Garriboli, M., Riegler, J., Orlando, G., Burns, A.J, et al. (2012). Каркас децеллюляризованного тонкого кишечника крысы, который сохраняет структуру ворсинок-крипт для регенерации кишечника. Биоматериалы 33, 3401–3410. DOI: 10.1016 / j.biomaterials.2012.01.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Верстеген, М.M.A., Willemse, J., van den Hoek, S., Kremers, G.J., Luider, T.M., van Huizen, N.A., et al. (2017). Децеллюляризация трансплантатов цельной печени человека с использованием контролируемой перфузии для трансплантируемых биоскаффолдов органов. Stem Cells Dev. 26, 1304–1315. DOI: 10.1089 / scd.2017.0095

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вагнер Д. Э., Боненфант Н. Р., Сокочевич Д., ДеСарно М. Дж., Борг З. Д., Парсонс К. С. и др. (2014). Трехмерные каркасы бесклеточных легких человека и свиньи для высокопроизводительных исследований заболеваний легких и регенерации. Биоматериалы 35, 2664–2679. DOI: 10.1016 / j.biomaterials.2013.11.078

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, К., Цен, Л., Инь, С., Лю, К. Х., Лю, В., Цао, Ю. Л. и др. (2010). Стенка эластичного кровеносного сосуда малого диаметра, полученная в пульсирующих условиях из сетки полигликолевой кислоты и гладкомышечных клеток, дифференцированных из стволовых клеток, полученных из жировой ткани. Биоматериалы 31, 621–630. DOI: 10.1016 / j.biomaterials.2009.09.086

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вейманн, А., Патил, Н. П., Сабашников, А., Юнгеблут, П., Коркмаз, С., Ли, С. Л. и др. (2014). Биоискусственное сердце: модель свиньи размером с человека — путь вперед. PLoS ONE 9: e111591. DOI: 10.1371 / journal.pone.0111591

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ясуи, Х., Ли, Дж. К., Йошида, А., Йокояма, Т., Наканиси, Х., Мива, К. и др. (2014). Распространение возбуждения в трехмерных сердцах с использованием децеллюляризованного внеклеточного матрикса. Биоматериалы 35, 7839–7850.DOI: 10.1016 / j.biomaterials.2014.05.080

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zhao, Y., Zhang, S., Zhou, J. Y., Wang, J. L., Zhen, M. C., Liu, Y., et al. (2010a). Разработка тканевой артерии с использованием децеллюляризованного каркаса и аутологичных мезенхимальных стволовых клеток овцы. Биоматериалы 31, 296–307. DOI: 10.1016 / j.biomaterials.2009.09.049

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжао, Ю., Xu, Y., Zhang, B., Wu, X., Xu, F., Liang, W., et al. (2010b). In vivo образование толстой васкуляризированной ткани печени из печеночных единиц на основе коллагенового гидрогеля. Tissue Eng Part C Methods 16, 653–659. DOI: 10.1089 / ten.tec.2009.0053

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжоу, Х., Китано, К., Рен, X., Раджаб, Т. К., Ву, М., и Гилпин, С. Е. (2017). Биоинженерия трансплантатов легких человека на свином матриксе. Ann. Surg. 267, 590–598.DOI: 10.1097 / SLA.0000000000002129

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zhu, L., Gong, D., Zou, Y., Li, Y., Wu, Y., Yuan, B., et al. (2008). Шейная гетеротопическая трансплантация тонкого кишечника крысам с использованием рукавного анастомоза артерии. Трансплантат. Proc. 40, 1645–1649. DOI: 10.1016 / j.transproceed.2008.03.146

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Циммерманн, К. В. (1923). Der feinere bau der blutkapillaren. З. Анат. Entwicklungsgesch 68, 29–109. DOI: 10.1007 / BF025

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Разница в способностях вертикальных прыжков, выносливости и скорости регенерации групп мышц нижних конечностей после физических нагрузок между кроссфитами и скалолазами

1. Робертсон Д.Г., Флеминг Д. Кинетика прыжков в длину и вертикальных прыжков с места. Может J Sport Sci. 1987; 12 (1): 19-23. Поиск в Google Scholar

2. Арагон-Варгас LF, Gross MM.Кинезиологические пределы выполнения вертикальных прыжков: различия между людьми. Медико-спортивные упражнения. 1995; 27: 170. Поиск в Google Scholar

3. Форд К.Р., Майер Г.Д., Брент Дж. Л., Хьюет Т.Э. Моменты разгибателей бедра и колена позволяют прогнозировать высоту вертикального прыжка у девочек-подростков. J Strength Cond Res. 2009; 23 (4): 1327-31. Поиск в Google Scholar

4. Беллар Д., Хэтчетт А., судья Л. В. и др. Взаимосвязь аэробной способности, анаэробной пиковой мощности и опыта с результатами в упражнениях CrossFit.Биол Спорт. 2015; 32 (4): 315-20. Поиск в Google Scholar

5. Хак П.Т., Ходзович Э., Хики Б. Природа и распространенность травм во время тренировок по кроссфиту. J Strength Cond Res. 2013; 22. DOI: 10.1519 / JSC.0000000000000318.10.1519 / JSC.0000000000000318Открыть DOISearch в Google Scholar

6. Клищевич Б., Куиндри С.Дж., Блессинг Л.Д. и др. Острые упражнения и окислительный стресс: CrossFitTM против беговой дорожки. J Hum Kinet. 2015; 47: 81-90. Поиск в Google Scholar

7. Smith MM, Sommer AJ, Starkoff BE, Devor ST.Высокоинтенсивные силовые тренировки на основе кроссфита улучшают максимальную аэробную форму и композицию тела. J Strength Cond Res. 2013; 27 (11): 3159-72. Поиск в Google Scholar

8. Weisenthal BM, Beck CA, Maloney MD, et al. Частота травм и характер травм среди спортсменов CrossFit. Orthop J Sports Med. 2014; 2 (4): 2325967114531177. Поиск в Google Scholar

9. Гиншт М., Гоневич М., Гинст А., Гоневич К. Травмы при лазании среди детей и молодежи. Perfekta Info. 2011: 137-45. Поиск в Google Scholar

10.Лаффай Г. Определяющие факторы способности лазать: влияние силы, антропометрии и нервно-мышечной усталости. Scand J Med Sci Sports. 2016; 26 (10): 1151-9. Поиск в Google Scholar

11. Лаффай Дж., Коллин Дж. М., Левернье Дж., Падуло Дж. Тест силы верхних конечностей при скалолазании. Int J Sports Med. 2014; 35 (8): 670-5. Поиск в Google Scholar

12. MacLeod D, Sutherland DL, Buntin L, et al. Физиологические факторы, определяющие выносливость пальцев, специфичную для лазания, и спортивные результаты в скалолазании.J Sports Sci. 2007; 25 (12): 1433-43. Поиск в Google Scholar

13. Штерн Дж. Т., Паре Э. Б., Шварц Дж. М.. Новые взгляды на использование мышц во время передвижения: электромиографические исследования быстрого и сложного поведения. J Am Osteopath Assoc. 1980; 80 (4): 287-91. Поиск в Google Scholar

14. Бартлетт Дж. Л., Самнер Б., Эллис Р. Г., Крам Р. Активность и функции ягодичных мышц человека при ходьбе, беге, спринте и лазании. Am J Phys Anthropol. 2014; 153 (1): 124-31. Искать в Google Scholar

15.Хорст Э. Максимальное лазание: умственная тренировка для максимальной производительности и оптимального опыта. Гилфорд: Роуман и Литтлфилд; 2010. Поиск в Google Scholar

16. Кэмпбелл А.Д., Дэвис К., Патерсон Р. и др. Предварительная оценка для альпинистских видов спорта. Clin J Sport Med. 2015; 25 (5): 412-7. Поиск в Google Scholar

17. Гинзт М., Гоневич М., Гинст А. Анализ причин и последствий травм среди детей и молодежи при спортивном скалолазании. Hygeia Public Health. 2012; 47 (1): 23-7.Ищите в Google Scholar

18. Oh H, Cha G, Oh S. Samba: Система захвата движения в реальном времени с использованием беспроводных сенсорных сетей камер. Датчики. 2014; 14 (3): 5516-35. Поиск в Google Scholar

19. Van Daele U, Huyvaert S, Hagman F и др. Воспроизводимость измерения постурального контроля во время нестабильного сидения у пациентов с болью в пояснице. BMC Musculoskelet Disord. 2007; 8 (1): 44. Поиск в Google Scholar

20. Etnoyer J, Cortes N, Ringleb SI, et al. Обучение и кинематика прыжков через приземление у спортсменок студенческого возраста с течением времени.J Athl Train. 2013; 48 (2): 161-71. Поиск в Google Scholar

21. Данешджу А., Абу Осман Н.А., Сахебозамани М., Юсоф А. Анализ маневров прыжков-приземлений футболистов на разных скоростях. PLoS ONE. 2015; 10 (11): e0143323. Поиск в Google Scholar

22. Krafft FC, Eckelt M, Köllner A, et al. Воспроизводимость пространственно-временных и динамических параметров в различных повседневных условиях поворота. Поза походки. 2015; 41 (1): 307-12. Искать в Google Scholar

23.Mello RGT, Carri IR, da Matta TT и др. Электромиограммы поясничного многораздельного и выпрямляющего позвоночника во время упражнений на задний мост во временной и частотной областях. J Back Musculoskelet Rehabil. 2016; 29 (1): 123-33. Поиск в Google Scholar

24. Нидерер Д., Фогт Л., Пиппиг Т. и др. Локальная мышечная утомляемость и трехмерная кинематика шейного отдела позвоночника у здоровых испытуемых. J Mot Behav. 2015; 16: 1-9. Поиск в Google Scholar

25. Райнольди А., Фалла Д., Меллор Р. и др. Миоэлектрические проявления усталости в мышцах широкой мышцы бедра, косой медиальной мышцы и длинной медиальной мышцы.J Electromyogr Kinesiol. 2008; 18 (6): 1032-7. Поиск в Google Scholar

26. Ван Лунен Б.Л., Робертс Дж., Бранч Д.Д., Даулинг Э.А. Связь гормональных изменений менструального цикла с измерениями слабости передней крестообразной связки. J Athl Train. 2003; 38 (4): 298-303. Поиск в Google Scholar

27. Tessier J-F, Basset F-A, Simoneau M, Teasdale N. Сила нижних конечностей не может быть точно оценена с помощью тестов с вертикальным прыжком. J Hum Kinet. 2013; 38: 5-13. Поиск в Google Scholar

28. Ванноп JW, Worobets JT, Stefanyshyn DJ.Нормализация сил реакции опоры, суставных моментов и свободных моментов при передвижении человека. J Appl Biomech. 2012; 28 (6): 665-76. Поиск в Google Scholar

29. Кимура Ю., Ишибаши Ю., Цуда Э, Ямамото Ю., Хаяси Ю., Сато С. Повышенное выравнивание коленного сустава и момент при приземлении на одну ногу после над головой инсульт как потенциальный фактор риска повреждения передней крестообразной связки в бадминтоне. Br J Sports Med. 2012; 46 (3): 207-13. Поиск в Google Scholar

30. McCann MR, Flanagan SP.Влияние выбора упражнений и интервала отдыха на постактивационную потенциацию выполнения вертикальных прыжков. J Strength Cond Res. 2010; 24 (5): 1285-91. Поиск в Google Scholar

31. Morrison AB, Schöffl VR. Физиологические реакции на скалолазание у молодых скалолазов. Br J Sports Med. 2007; 41 (12): 852-61. Искать в Google Scholar

% PDF-1.7
%
580 0 объект
>
эндобдж

xref
580 86
0000000016 00000 н.
0000003115 00000 н.
0000003260 00000 н.
0000003296 00000 н.
0000004448 00000 н.
0000004587 00000 н.
0000004726 00000 н.
0000004865 00000 н.
0000005002 00000 н.
0000005139 00000 п.
0000005276 00000 н.
0000005415 00000 н.
0000005552 00000 н.
0000005690 00000 н.
0000005829 00000 н.
0000005968 00000 н.
0000006105 00000 н.
0000006243 00000 н.
0000006381 00000 п.
0000006520 00000 н.
0000006658 00000 н.
0000006695 00000 н.
0000006809 00000 н.
0000008051 00000 н.
0000008888 00000 н.
0000010066 00000 п.
0000010795 00000 п.
0000011159 00000 п.
0000011888 00000 п.
0000012000 00000 н.
0000012465 00000 п.
0000013040 00000 п.
0000013129 00000 п.
0000013435 00000 п.
0000013763 00000 п.
0000014249 00000 п.
0000014853 00000 п.
0000016141 00000 п.
0000016953 00000 п.
0000017048 00000 п.
0000017753 00000 п.
0000018472 00000 п.
0000019607 00000 п.
0000020141 00000 п.
0000020585 00000 п.
0000020677 00000 п.
0000021127 00000 п.
0000021682 00000 п.
0000021766 00000 п.
0000022178 00000 п.
0000022690 00000 н.
0000024031 00000 п.
0000025225 00000 п.
0000026434 00000 п.
0000029084 00000 п.
0000032963 00000 н.
0000033838 00000 п.
0000039170 00000 п.
0000042953 00000 п.
0000047039 00000 п.
0000050332 00000 п.
0000086125 00000 п.
0000086164 00000 п.
0000121957 00000 н.
0000121996 00000 н.
0000153834 00000 н.
0000153873 00000 н.
00001 00000 н.
00001 00000 н.
00001 00000 н.
00001 00000 н.
00001
00000 н.
00001
00000 н.
00001 00000 н.
00001 00000 н.
00001 00000 н.
00001 00000 н.
00001
00000 н.
00001
00000 н.
00001 00000 н.
00001
00000 н.
00001 00000 н.
00001

00000 н.
00001
00000 н.
00001
00000 н.
0000002016 00000 н.
трейлер
] / Назад 9711537 >>
startxref
0
%% EOF

665 0 объект
> поток
hb«d` (d`g`P`c @

Последние достижения в механизмах интеграции сигналов в…

Введение

Ответ развернутого белка (UPR) включает набор эволюционно законсервированных сигнальных путей у эукариот, которые контролируют функции эндоплазматического ретикулума (ER). В своей наиболее фундаментальной форме UPR поддерживает здоровье секретируемых и трансмембранных белков. Большинство этих белков, которые составляют примерно одну треть протеома, перемещаются в ER для их укладки и созревания. Поскольку эти белки устанавливают коммуникационные сети между клетками и между клетками и внеклеточной средой, UPR необходим для нормальной физиологии клеток и организма.В самом деле, давно известно, что UPR важен для дифференцировки, развития и поддержания профессиональных секреторных клеток и секреторных тканей 1–7 . Однако функции UPR не ограничиваются этими тканями, поскольку все ключевые сенсоры / преобразователи UPR у многоклеточных животных экспрессируются повсеместно и поддерживают разнообразные процессы в разных тканях 8-15 .

Резидентные датчики ER, которые обнаруживают нарушения состава и функции ER, обычно известные как «стресс ER», инициируют UPR (рассмотрено в 16).Стресс ER возникает, когда способность ER к сворачиванию или деградации превышена (например, при экспрессии мутантных белков, которые не могут быть правильно свернуты, или при выведении из строя систем контроля качества ER мутациями или патогенами). UPR передает информацию о статусе ER в ядро ​​клетки, индуцируя экспрессию факторов транскрипции 17–21 . UPR также осуществляет посттранскрипционный контроль, регулируя синтез белка и стабильность мРНК 22–24 .Координация транскрипционных и посттранскрипционных механизмов UPR определяет клеточное решение о том, адаптироваться или умирать, если ER стресс является непреодолимым.

Тысячи опубликованных на сегодняшний день статей (поиск в PubMed по запросу «развернутый белковый ответ» показывает более 7800 статей, в том числе более 3800 статей только за последние пять лет) раскрыли внутреннюю работу УПО и представили его как сложный сеть взаимосвязанных сигнальных путей. В этом обзоре мы обсуждаем новые разработки в механизмах передачи сигналов UPR, связи между путями передачи сигналов UPR у многоклеточных животных и передачу сигналов UPR за пределы ER.

Сигнальная трансдукция в UPR: ранние модели и новые идеи

Три ER-трансмембранных датчика стресса контролируют UPR: киназа / эндорибонуклеаза IRE1, киназа PERK и связанный с мембраной фактор транскрипции ATF6 (обзор в 16). Эволюционная консервация дала первые ключи к разгадке специализации в передаче сигналов UPR, которая, возможно, возникла с появлением многоклеточности. IRE1 повсеместно обнаруживается от дрожжей до многоклеточных, тогда как PERK и ATF6 появляются только у животных 25 .Что касается обнаружения стресса ER, классический взгляд утверждает, что IRE1, PERK и ATF6 обнаруживают нарушения сворачивания белков в просвете ER. В последнее время все они были предложены для определения дисбаланса липидного состава мембраны ER 26–31 . Все чаще признается, что дефицит ER, ведущий к протео- или липотоксичности, устраняется UPR с помощью различных регуляторных механизмов (см. Обзор 32). Эти результаты объединяются в модель, в которой датчики UPR работают вместе, объединяя информацию об отдельных / различных недостатках ER для запуска гомеостатических или апоптотических программ.

IRE1 и PERK обнаруживают стресс ER путем прямого связывания развернутых белковых лигандов в просвете ER, а обратимая диссоциация IRE1 и PERK от шаперона просвета ER BiP регулирует их динамику активации / дезактивации 33–41 . Хотя взаимодействие BiP с UPR сенсорами известно давно, другие взаимодействия между UPR сенсорами и ER шаперонами были обнаружены только недавно. Например, ко-шаперон ERDJ4 специфически способствует взаимодействию BiP с IRE1 38 , а активность IRE1 и PERK точно настраивается различными шаперонами ER, обеспечивая тканевую и контекстно-зависимую регуляцию UPR.Протеин-дисульфидизомераза PDIA6 модулирует дезактивацию IRE1 и PERK 42,43 , а шаперон ER HSP47 связывается с IRE1, но не с PERK, чтобы регулировать его активность 44 . Напротив, гомолог 2 люменального белка ER (CNPY2) связывается только с PERK во время стресса ER, чтобы регулировать передачу сигналов ниже по течению 45 . Более того, в клетках скелетных мышц ER оксидоредуктаза кальсеквестрин связывает IRE1, чтобы ингибировать его активность 46 . Эти результаты подтверждают точку зрения, согласно которой сигнальная способность датчиков UPR может быть уточнена, чтобы приспособиться к конкретным выходным сигналам в соответствии с конкретными потребностями клеток и тканей.Скорее всего, вышеупомянутые взаимодействия UPR сенсоров с шаперонами также влияют на временную динамику активации и деактивации UPR передачи сигналов, тем самым обеспечивая дополнительный уровень регуляторного контроля, ведущего к решению жизни против смерти в клетках 47-50 . Таким образом, модуляция UPR на уровне взаимодействий UPR сенсор-шаперон служит начальной точкой для интеграции информации, чтобы регулировать сложные нисходящие выходы UPR.

Как ATF6, по сравнению с IRE1 и PERK, обнаруживает напряжение ER, менее изучено.Установленная модель утверждает, что стресс ER ведет к экспорту ATF6 в аппарат Гольджи, где резидентные протеазы расщепляют его с высвобождением растворимого фактора транскрипции, ATF6N 51,52 . Накапливаются данные, свидетельствующие о том, что ATF6 может действовать как окислительно-восстановительный датчик или что он связан с ним, поскольку уменьшение внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей в его просветном домене ER, по-видимому, необходимо для доставки в аппарат Гольджи 53 . Недавнее наблюдение аберрантной и ослабленной передачи сигналов ATF6 в клетках, дефицитных по оксидоредуктазе ERp18, которая ассоциируется с ATF6 во время стресса ER, поддерживает эту точку зрения 54 .

Самоассоциация / диссоциация датчиков UPR — еще одна каноническая особенность UPR. ER стресс-индуцированная олигомеризация IRE1 и PERK в плоскости мембраны ER управляет trans -аутофосфорилированием их соответствующих цитозольных киназных доменов (rev. 16). Активный PERK фосфорилирует eIF2α (альфа-субъединица, фактор инициации трансляции 2 эукариот), вызывая снижение общего синтеза белка 24 . Парадоксально, но субнабор мРНК, несущих небольшие вышестоящие открытые рамки считывания (uORF) на своих 5′-нетранслируемых областях (5′-UTRs), предпочтительно транслируется в этих условиях, включая те, которые кодируют факторы транскрипции ATF4 и CHOP 21,55-58 .Увеличивая клеточную метаболическую емкость, эффекты ATF4 в основном являются цитопротекторными 59 , тогда как CHOP в значительной степени рассматривается как проапоптотический 60–63 . Недавно было показано, что в дополнение к контролю трансляции с помощью uORFs, метилирование N6-метиладенозином (m6A) мРНК ATF4 также способствует контролю его трансляции. Деметилирование 5′-UTR мРНК ATF4 деметилазой ALKBH5 усиливает ее реинициацию трансляции, способствуя синтезу ATF4 во время стресса ER 64 .Этот механизм подчеркивает тонкую настройку перепрограммирования синтеза белка во время стресса.

В отличие от PERK, IRE1 не имеет известных субстратов киназы, кроме самого себя, и его активный киназный домен лицензирует аллостерическую активацию его C-концевого домена РНКазы 65,66 . Активный IRE1 вырезает небольшой нетрадиционный интрон из мРНК, кодирующей фактор транскрипции XBP1 18,19 . Образовавшиеся экзоны соединяются тРНК-лигазой RTCB с образованием новой мРНК, кодирующей фактор транскрипции XBP1S («S», для сплайсинга) 67–69 .Несмотря на то, что сплайсинг мРНК XBP1 был открыт почти 20 лет назад, некоторые важные особенности этого механизма были выяснены недавно. Пять лет назад RTCB был независимо идентифицирован тремя группами как XBP1 лигаза сплайсинга мРНК 67–69 . Вскоре после 70 было описано конформационное изменение в мРНК XBP1 , названное «застежкой-молнией» РНК, которая требуется для выброса интрона и удержания экзонов вместе после расщепления. Дополнительная недавняя работа показала, что интактный 2′-3 ‘циклический фосфат — давно известно, что он остается на концах РНК после расщепления IRE1 71 — необходим для завершения реакции сплайсинга мРНК XBP1 72 .Противоположные активности циклической фосфодиэстеразы CNP и РНКциклазы RTCA контролируют доступность циклического фосфата 72 . Целевой количественный протеомный анализ показал, что IRE1 обнаруживается в комплексе с RTCB в клетках 73 , что позволяет предположить, что сплайсинг мРНК XBP1 может быть завершен сразу после расщепления мРНК. Эта недавно описанная многоступенчатая регуляция сплайсинга мРНК XBP1 может также обеспечивать регуляторные уровни, контролирующие настраиваемый выход UPR.

Передача сигналов

IRE1 не ограничивается сплайсингом мРНК XBP1 . IRE1 также расщепляет связанные с ER мРНК в процессе, известном как регулируемый IRE1-зависимый распад (RIDD) 22,23 . При первом открытии считалось, что RIDD защищает ER за счет снижения нагрузки на ER посредством избирательного расщепления мРНК 23 ; однако недавние открытия ставят под сомнение эту точку зрения. Было показано, что RIDD одиночной мРНК, кодирующей фактор переноса лизосом BLOS1, защищает клетки от протеотоксичности, увеличивая их способность разрушать агрегаты белков с помощью микроаутофагии 74 .Точный молекулярный механизм, который определяет судьбу мРНК, сталкивающейся с IRE1 — сплайсинг или RIDD — по-видимому, зависит от вышеупомянутой застежки мРНК XBP1 , которая отсутствует у мишеней RIDD, изученных на сегодняшний день; имплантация этой структуры мРНК-застежки-молнии в мРНК-мишени RIDD приводит к их сплайсингу 75 .

В последнее время наше понимание механизмов передачи сигналов IRE1 также расширилось. Несколько линий доказательств подтверждают представление о том, что IRE1 является интегрирующим узлом, связывающим UPR и аппарат нацеливания на ко-трансляцию белков ER.Было показано, что IRE1 связывается с транслоконом Sec61 76 , и нарушение этого взаимодействия приводит к нарушению регуляции активности IRE1 77 . Недавно разработанный метод Perturb-seq, который комбинирует одноклеточную RNA-seq с генетическим скринингом на основе CRISPR, дополнительно подтвердил эти наблюдения, показывая, что истощение субъединиц транслокона приводит к исключительной активации IRE1 без влияния на другие пути передачи сигналов UPR 78 . Совсем недавно подходы, основанные на перекрестном связывании РНК-белков и масс-спектрометрии, показали, что IRE1 ассоциирует с частицей распознавания сигнала, тРНК, мРНК и рибосомами в живых клетках 73 .Все эти наблюдения сходятся в модели, в которой IRE1 наблюдает за работоспособностью и доступностью трансклоконов, в то время как он контролирует механизм совместного трансляционного нацеливания на поверхности ER.

Перекрестная связь между сигнальными путями UPR контролирует адаптацию и смерть

Базовый уровень взаимосвязанности путей в UPR включает скоординированные действия факторов транскрипции. В адаптивной фазе UPR ATF6N и XBP1S увеличивают синтез шаперонов, ферментов сворачивания белков и белков, которые участвуют в механизмах оборота белков ER, и они физически увеличивают ER за счет активации биосинтеза эндомембраны 9,79–83 .Параллельно ATF4 усиливает биосинтетическую способность клетки, контролируя гены, необходимые для антиоксидантных реакций и импорта аминокислот 59 . Адаптивные транскрипционные сигналы далее интегрируются на уровне комбинаторной регуляции. Например, ATF6N и XBP1S могут образовывать гетеродимеры 84 , тем самым расширяя репертуар UPR цис -регулирующих элементов 9,20,83,85,86 . Посттранскрипционный регуляторный контроль с помощью XBP1U («U» для несплицированного), кодируемого мРНК предшественника XBP1 , регулирует транскрипционные ответы; XBP1U регулирует оборот XBP1S и ATF6N, устанавливая молекулярный таймер на продолжительность адаптивной фазы UPR 87,88 .

Не все выходные данные транскрипции UPR являются адаптивными. ATF4, ATF6N и XBP1S сходятся при индукции CHOP 9,21,83,85 , что отрицательно влияет на способность сворачивания белка ER, подавляет антиапоптотический белок BCL2 и усиливает рецептор смерти проапоптотического сигнального белка. 5 (DR5) 50,61,63,89,90 . Однако недавние данные, показывающие, что генетическое истощение ATF6 — но не IRE1 или PERK — значительно нарушает рост клеток HeLa, сконструированных для принятия секреторного фенотипа, подобного плазматическим клеткам, который предрасполагает их к стрессу ER, предполагают, что ATF6 в основном является цитопротекторным 91 .Гомеостатическая роль оси IRE1-XBP1 недавно была поставлена ​​под вопрос открытием цитотоксических XBP1-управляемых ответов 92 . Эти данные показывают, что превышение критического порога стресса ER позволяет XBP1S косвенно индуцировать экспрессию кальциевых каналов ER TMEM38B и ITPR1, что приводит к истощению запасов кальция ER, тем самым обеспечивая петлю положительной обратной связи для усиления стресса ER 92 . В этой модели гибель клеток возникает из-за побочного повреждения, вызванного транскрипционным фактором KLF9 ниже XBP1S, а не из-за прямого контроля bona fide проапоптотических генов с помощью XBP1S.

XBP1-независимые роли в отношении цитопротекции или апоптоза также были предложены для IRE1. Одна модель предполагает, что IRE1 способствует гибели клеток за счет деградации микроРНК (miRNAs), нацеленной на мРНК, кодирующие проапоптотические белки TXNIP и каспазу-2 93,94 . Эта модель несколько оспаривается, поскольку каспаза-2, по-видимому, незаменима для индукции гибели клеток в ответ на стресс ER 50,95 . Другая точка зрения утверждает, что RIDD может приводить к гибели клеток через всепроникающее расщепление РНК 96 .Представление об антагонистических ролях IRE1 было дополнительно подтверждено недавними находками, показывающими, что XBP1S способствует прогрессированию опухолей глиобластомы, тогда как RIDD препятствует этому 97 .

Антагонизм среди UPR сенсоров также обеспечивает модель UPR-зависимого контроля клеточной судьбы. Эта модель рассматривает динамический перекрестный обмен между цитопротективными и проапоптотическими сигналами, исходящими от разных датчиков UPR. IRE1 способствует цитопротекции посредством сплайсинга мРНК XBP1 и RIDD, тогда как PERK способствует апоптозу, индуцируя ось ATF4-CHOP и ген, кодирующий DR5, расположенный ниже нее 50 .Передача сигналов DR5 предписывает клеткам умирать в ответ на непреодолимый стресс ER через внешний (зависимый от каспазы-8) путь апоптоза; IRE1 борется с апоптотическим сигналом, разрушая мРНК DR5 50 . Одновременно фосфатаза RPAP2, расположенная ниже PERK, дефосфорилирует IRE1, ослабляя передачу сигналов IRE1 98 . Наряду с RPAP2, оборот IRE1, опосредованный каспазой, также может играть роль в прекращении передачи сигналов и обеспечении выполнения программы апоптоза 99 .Неожиданно, расщепление IRE1 каспазами также генерирует протеолитический фрагмент, который противодействует BAX-управляемой проапоптотической передаче сигналов от митохондрий 99 , дополнительно подтверждая идею обширного функционального перекрестного взаимодействия между UPR и другими фундаментальными клеточными процессами.

PERK также стимулирует продукцию GADD34, регуляторной субъединицы PP1 (протеинфосфатазы 1), которая дефосфорилирует eIF2α, тем самым создавая отрицательную петлю обратной связи, контролирующую ответы ниже PERK 100,101 .Перекрестная связь между сигнальными путями UPR была дополнительно подтверждена недавними экспериментами по RNA-seq и рибосомному профилированию, которые показывают, что PERK обладает потенциалом репрессировать — как транскрипционно, так и посттранскрипционно — экспрессию субнабора цитопротекторных генов, индуцированных XBP1S и ATF6N 102 . Вместе эти наблюдения подтверждают модель, в которой молекулярный таймер, запускаемый противоположными сигналами ниже IRE1 и PERK, координирует решение о выживании и смерти.В этой модели действия IRE1 и PERK скоординированы, гарантируя, что конкретные ответы срабатывают по мере развития реакции на стресс ER. В начале ответа гомеостатические механизмы усиливаются, в то время как апоптотические механизмы подавляются (например, индукция сплайсинга мРНК XBP1 , RIDD мРНК DR5 ). Если стресс продолжается, механизмы апоптоза вступают во владение (например, отключение передачи сигналов IRE1, подавление цитопротекторных генов ниже XBP1S и ATF6).

Помимо механизмов, обсуждаемых выше, механизмы контроля качества белка сенсоров UPR участвуют в передаче сигналов UPR; уровни белков IRE1, PERK и ATF6 контролируются ER-ассоциированной деградацией (ERAD) 103–105 . Эти наблюдения предполагают, что ERAD задействует петли отрицательной обратной связи, которые могут способствовать принятию решения о выживании или смерти. Более того, недавние данные подтверждают, что посттрансляционная модификация IRE1 и PERK с помощью ufmylation, которая регулирует их стабильность, играет важную роль в регуляции апоптоза и развития плазматических клеток 106,107 .Важно, что посттранскрипционные механизмы работают вместе с устройствами оборота белка, чтобы регулировать UPR. Все чаще признается, что некодирующие РНК — в основном miRNAs, но также и длинные некодирующие РНК — действуют как важные регуляторы UPR (rev. 108). Этот тип регулятивного контроля добавляет уровень сложности гомеостатическим или апоптотическим программам, контролируемым UPR.

За пределами ER: неканонические механизмы UPR и межорганеллярная коммуникация

По мере продвижения в нашем понимании UPR мы пришли к пониманию, что передача сигналов UPR выходит за рамки защиты физиологии ER.Недавние наблюдения подтверждают неотъемлемую роль UPR в качестве центра межорганической коммуникации. В сайтах контакта ER-митохондриальной мембраны IRE1 координирует физиологическую биоэнергетику митохондрий, задействуя кальциевый канал ITPR 109 . Регуляция IRE1 в соединениях ER-митохондрии также настраивает биомедицинские процессы, такие как регуляция ответов Т-клеток 110 . Параллельно PERK стимулирует сборку суперкомплексов дыхательной цепи питательным и ER стресс-зависимым образом 111,112 .Взаимодействие UPR-митохондрии является двунаправленным: геномный скрининг с высоким содержанием у дрожжей продемонстрировал, что биосинтез митохондриального гема обеспечивает оптимальную передачу сигналов UPR 113 . Совсем недавно было показано, что митохондриальная убиквитинлигаза MITOL убиквитилирует IRE1 в сайтах контакта ER-митохондрий, чтобы подавлять его активность и предотвращать апоптоз 114 . Эти исследования демонстрируют сохраняющуюся роль UPR как интеграционного узла для межорганической коммуникации.

IRE1 и PERK также обнаруживаются в сайтах контакта ER-плазматической мембраны (ER-PM) благодаря их ассоциации с цитоскелетным каркасом filamin A (FLNA).PERK-управляемое рекрутирование FLNA расширяет контакты ER-PM и пополняет запасы кальция ER 115 , в то время как IRE1 задействует FLNA для облегчения подвижности клеток 116 . Эти механизмы UPR не зависят от ферментативной активности IRE1 или PERK, полагаясь вместо этого на динамическую кластеризацию сенсоров UPR. Неожиданно роль перекрестного взаимодействия UPR и органелл в модуляции передачи сигналов UPR была дополнительно проиллюстрирована наблюдением, что ceapins, недавно открытые ингибиторы передачи сигналов ATF6 117,118 , работают, обеспечивая неоморфную искусственную связь между ER и пероксисомами 119 .

Несмотря на убедительные доказательства, подтверждающие неканоническую роль передачи сигналов IRE1, недавнее сообщение продемонстрировало, что сплайсинг мРНК XBP1 является единственной активностью IRE1, необходимой для развития и роста рыб медака 120 . Однако это наблюдение не отрицает значимости перекрестных связей между UPR и другими клеточными процессами в поддержании гомеостаза организма. В отличие от автономной транскрипционной программы, UPR управляет экспрессией отдельных наборов генов в зависимости от типа клетки и стимула, что включает метаболические, воспалительные или связанные с развитием сигналы 9,121,122 .Более того, из сотен регулируемых UPR генов многие не имеют прямых функций в поддержании гомеостаза ER. Напр., Некоторые гены-мишени UPR координируют реакцию на повреждение и репарацию ДНК, намекая на ключевую роль UPR в поддержании целостности генома 9,122,123 . Вместе канонические и неканонические механизмы, возникающие из разных сенсоров UPR — по крайней мере, для IRE1 и PERK — собираются в многопоточное сигнальное реле, которое, скорее всего, определяет надежность UPR при координации активности других органелл и функций внутри клетки.

Интеграция сигнала UPR на уровне организма

Взаимосвязанная природа передачи сигналов UPR не ограничивается отдельными клетками, поскольку становится все более очевидным, что неавтономный UPR клетки играет роль в поддержании здоровья организма. Работа в Caenorhabditis elegans показала, что IRE1 регулирует стрессоустойчивость и продолжительность жизни посредством неидентифицированного диффузионного фактора, который является последующей мишенью для XBP1 124 . Более того, эктопическая экспрессия XBP1S в нейронах мыши приводит к стрессовым ответам в печени и улучшает чувствительность печени к инсулину 125 .Совсем недавно была выяснена роль UPR в поддержании (или нарушении) циркадных ритмов у животных. Посредством комбинированного действия транскрипционных и трансляционных механизмов UPR регулирует экспрессию циркадных факторов, чтобы гарантировать осцилляторный контроль метаболических ритмов 126,127 . С другой стороны, в условиях стресса ER PERK ингибирует циркадные гетеродимерные компоненты BMAL1 и CLOCK, отменяя клеточные ритмы в клетках и животных 128,129 .

Фундаментальные роли UPR в координации гомеостаза на уровне организма дополнительно подчеркиваются потенциалом терапевтического применения недавно открытых низкомолекулярных модуляторов UPR. В некоторых случаях может быть желательным подавление передачи сигналов UPR для благоприятного исхода, как было недавно продемонстрировано для фармакологического ингибирования IRE1 в ортотопических моделях множественной миеломы 130 и атеросклероза 131 , или путем блокирования функций IRE1 в качестве многообещающей стратегии. для обезболивания 132 .В других случаях может быть желательно усилить передачу сигналов UPR для увеличения способности ER обрабатывать белок. Недавно обнаруженные селективные активаторы ATF6 являются многообещающими в этом отношении, поскольку они уменьшают агрегацию амилоидогенного белка и протеотоксичность в различных моделях заболеваний, включая ишемию миокарда 133–135 . Положительные эффекты низкомолекулярного ISRIB, который делает клетки нечувствительными к эффектам фосфорилирования eIF2α 136 , на модели неврологических расстройств и повреждений головного мозга дополнительно подтверждают это мнение.Например, ISRIB устраняет последствия генетических мутаций, наблюдаемых при исчезающей болезни белого вещества 137 , устраняет когнитивные дефициты в мышиных моделях черепно-мозговой травмы 138 , устраняет социальные поведенческие дефекты и симптомы тревоги в генетической модели мыши 139 , и защищает нервные клетки в мышиных моделях прионной болезни 140 . Важно отметить, что небольшая молекула, называемая Sephin1, которая, как предполагается, препятствует дефосфорилированию eIF2α, также обеспечивает терапевтическую пользу на мышиных моделях нейропатологий неправильного сворачивания белков 141–143 .Эти данные подчеркивают возможность контроля фосфорилирования eIF2α при различных патологиях. Все эти наблюдения подтверждают представление о том, что фармакологические манипуляции с UPR представляют собой привлекательную возможность для целенаправленного терапевтического вмешательства при множественных заболеваниях.

Взятые вместе, вышеупомянутые находки изображают восходящий взгляд на гомеостат UPR, который выходит за рамки поддержания гомеостаза ER. В иерархии UPR, на самом базовом уровне, UPR поддерживает физиологию ER.На следующем уровне UPR пересекается с клеточной физиологией через динамические связи между ER и другими клеточными компонентами и процессами. На более высоком уровне UPR объединяет сигналы на многоклеточном уровне, облегчая обмен информацией о конкретных состояниях между клетками и тканями и модулируя колебательную динамику ритмов организма. Связав фундаментальные биологические процессы на нескольких уровнях, UPR становится основным регуляторным центром, поддерживающим здоровье всего организма.

Что ждет в будущем механизмы сигнализации UPR?

За последние пять лет мы увидели большой прогресс в нашем понимании УПО. Эти события вызывают новые вопросы. Напр., Хотя мы знаем, что кластеризация важна для активации UPR сенсоров, мы не понимаем механизмов, которые д. Управлять их пространственно-временной организацией в специфических доменах мембраны ER. Мы также очень мало знаем о механистических деталях, которые лежат в основе функционального разделения каждого пути передачи сигналов UPR.Является ли основная функция IRE1 проверять целостность и доступность транслокона, в то время как другие гомеостатические функции делегированы ATF6? Ограничиваются ли проапоптотические функции в основном PERK? Значение других молекулярных механизмов также остается неясным. Существуют ли другие субстраты RIDD, которые, подобно BLOS1, контролируют специфические цитопротективные или проапоптотические ответы? Является ли рибосома сигнальным центром для IRE1 или PERK? Влияют ли неканонические механизмы UPR на дифференцировку клеток и тканей, или они существуют просто для точной настройки клеточных ответов на определенные физиологические состояния? Эти вопросы обеспечат плодородную почву для исследований на долгие годы.

Еще одно недавнее наблюдение, которое порождает новые вопросы, — это открытие, что не каждая клетка в популяции одинаково реагирует на один и тот же ввод стресса ER 78 . Возможно ли, что, подобно врожденному противовирусному ответу интерферона I типа, предупреждение соседних клеток о потенциальной угрозе для функций ER позволяет скоординированным ответам, которые поддерживают гомеостаз тканей и организма? Возможно ли, что клетки демонстрируют разные типы UPR в зависимости от того, активно ли они циклируются, необратимо вышли из клеточного цикла, готовясь к терминальной дифференцировке, или терминально дифференцированы? Дальнейшая работа, направленная на решение этих вопросов, может выявить новые парадигмы передачи сигналов UPR у многоклеточных организмов.

Различия в ответе на стресс ER отдельных клеток в асинхронной популяции сильно намекают на фундаментальную связь между передачей сигналов UPR и клеточным циклом. Обосновывая это предположение, дрожжевой гомолог XBP1 Hac1 участвует в цитокинезе 144 , а блокирование передачи сигналов IRE1 задерживает прогрессирование клеточного цикла в хелперных Т-клетках 145 . Кроме того, предполагается, что передача сигналов PERK отрицательно влияет на прогрессирование клеточного цикла 146,147 .Предполагаемая роль XBP1U в контроле пролиферации клеток была недавно обнаружена: XBP1U действует как негативный регулятор оси супрессора опухолей p53 / p21, показывая потенциальную онкогенную роль этого белка 148 . Хотя эта роль не зависит от IRE1, возможно, что он остается связанным с UPR, поскольку и ATF6N, и XBP1S индуцируют экспрессию мРНК XBP1 9,19 . Дальнейшая работа необходима, чтобы раскрыть механистические детали, лежащие в основе предполагаемой «контрольной точки здоровья ER» в клеточном цикле многоклеточных животных.

Обсуждаемые здесь события подчеркивают, что история UPR далека от завершения. Они изображают гораздо более сложную молекулярную схему UPR, чем предполагалось ранее. Эти новые знания об основных механизмах UPR могут кардинально изменить наши взгляды на то, как манипулировать UPR для терапевтического вмешательства. Становится ясно, что UPR — это гораздо больше, чем просто сумма его частей, и что это устройство сигнализации напряжения Руба Голдберга будет продолжать делать важные открытия еще долгие годы.

Сокращения

5 ‘UTR, 5’ нетранслируемая область; ALKBH5, гомолог 5 РНК-деметилазы AlkB; ATF4, активирующий фактор транскрипции 4; ATF6, активирующий фактор транскрипции 6; BAX, BCL2-ассоциированный X-белок; BCL2, регулятор апоптоза BCL2 / B-клеточный CLL / лимфома 2; BiP, связывающий белок иммуноглобулина; BLOS1, биогенез связанных с лизосомами органелл, комплекс 1 субъединица 1; BMAL1, мозговой и мышечный ARNT-подобный 1; CHOP, гомологичный белок CCAAT / энхансер-связывающий белок; ЧАСЫ, циркадные циклы вывода локомотера, белок капут; CNP, 2 ‘, 3’ циклический нуклеотид, 3 ‘фосфодиэстераза; CNPY2, гомолог 2 белка купола; CRISPR, сгруппированные с регулярными интервалами короткие палиндромные повторы; DR5, рецептор смерти 5; eIF2α, фактор инициации трансляции 2 эукариот, субъединица альфа; ER, эндоплазматический ретикулум; ERAD, деградация, связанная с ER; ERDJ4, ER DnaJ гомолог 4; ERp18, резидентный белок эндоплазматического ретикулума 18 кДа; FLNA, филамин А; GADD34, регуляторная субъединица 15A 34 / PP1, вызывающая остановку роста и индуцируемую повреждением ДНК; HSP47, белок теплового шока 47; IRE1, фермент 1, требующий инозитола; ISRIB, интегрированный ингибитор стрессовой реакции; ITPR1, инозитол-1,4,5-трифосфатный рецептор типа 1; KLF9, фактор типа Круппеля 9; m6A, N6-метиладенозин; миРНК, микроРНК; MITOL, митохондриальная убиквитинлигаза; PDIA6, член 6 семейства протеиндисульфидизомераз A; PERK, PKR-подобная киназа эндоплазматического ретикулума; ПМ, плазматическая мембрана; PP1, протеинфосфатаза 1; RIDD, регулируемый IRE1-зависимый распад; RPAP2, белок 2, связанный с РНК-полимеразой II; RTCA, 3’-концевая фосфатциклаза РНК; RTCB, гомолог RtcB лигазы для сплайсинга тРНК; TMEM38B, трансмембранный белок 38B; TXNIP, белок, взаимодействующий с тиоредоксином; uORF, открытая рамка считывания выше по течению; UPR — ответ развернутого белка; XBP1, связывающий белок X-box

Благодарности

Мы благодарим Каролину Ариас (Калифорнийский университет, Санта-Барбара) и сотрудников лаборатории Акоста-Альвеар за их предложения и критический пересмотр рукописи.

Рекомендуется F1000

Ссылки

  • 1. Реймольд AM, Ивакоши Н.Н., Манис Дж., et al. : Для дифференцировки плазматических клеток необходим фактор транскрипции XBP-1. Природа. 2001; 412 (6844): 300–7. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | F1000 Рекомендация
  • 2. Ивакоши Н.Н., Ли А.Х., Валлабхаджосюла П., et al. : дифференцировка плазматических клеток и ответ развернутого белка пересекаются по фактору транскрипции XBP-1. Nat Immunol. 2003; 4 (4): 321–9. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | F1000 Рекомендация
  • 3. Ли А.Х., Чу Г.К., Ивакоши Н.Н., и др. : XBP-1 необходим для биогенеза клеточного секреторного аппарата экзокринных желез. EMBO J. 2005; 24 (24): 4368–80. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Free Full Text
  • 4. Гасс Дж. Н., Гиффорд Н. М., Брюер Дж. У .: Активация развернутого белкового ответа во время дифференцировки В-клеток, секретирующих антитела. J. Biol Chem. 2002; 277 (50): 49047–54. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | F1000 Рекомендация
  • 5. Zhang K, Wong HN, Song B, et al. : Датчик ответа развернутого белка IRE1alpha необходим на 2 различных стадиях лимфопоэза В-клеток. J Clin Invest. 2005; 115 (2): 268–81. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 6. Гао Й, Сартори Д. Д., Ли К., и др. : PERK необходим в поджелудочной железе взрослого человека и необходим для поддержания гомеостаза глюкозы. Mol Cell Biol. 2012; 32 (24): 5129–39. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 7. Zhang W, Feng D, Li Y, et al. : PERK EIF2AK3 контроль дифференцировки и пролиферации бета-клеток поджелудочной железы необходим для постнатального гомеостаза глюкозы. Cell Metab. 2006; 4 (6): 491–7. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 8. Корнехо В.Х., Пихан П., Видал Р.Л., и др. : Роль развернутого белкового ответа в физиологии органов: уроки мышиных моделей. IUBMB Life. 2013; 65 (12): 962–75. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 9. Акоста-Альвеар Д., Чжоу Й., Блейс А., и др. : XBP1 контролирует различные транскрипционные регуляторные сети, специфичные для разных типов клеток и состояний. Mol Cell. 2007; 27 (1): 53–66. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | F1000 Рекомендация
  • 10. Дальтон Р.П., Лайонс Д.Б., Ломвардас С. Кооптация развернутого белкового ответа для выявления обратной связи с обонятельными рецепторами. Ячейка. 2013; 155 (2): 321–32. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 11. Чо Ю.М., Джанг Ю.С., Джанг Ю.М., et al. : индукция ответа развернутого белка во время нейрональной индукции стромальных клеток костного мозга крысы и эмбриональных стволовых клеток мыши. Exp Mol Med. 2009; 41 (6): 440. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 12. Кавада К., Иекумо Т., Сайто Р., и др.: Аберрантная дифференцировка нейронов и ингибирование роста дендритов в результате стресса эндоплазматического ретикулума. J Neurosci Res. 2014; 92 (9): 1122–33. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 13. Текко Т., Лиллевяли К., Луук Х, и др. : Инициирование и динамика развития экспрессии Wfs1 в контексте нейральной дифференцировки и стресса ER в переднем мозге мыши. Int J Dev Neurosci. 2014; 35 : 80–8.PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 14. Мартинес Г., Видал Р.Л., Мардонес П., и др. : Регуляция формирования памяти транскрипционным фактором XBP1. Cell Rep. 2016; 14 (6): 1382–94. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | F1000 Рекомендация
  • 15. Мурао Н., Нишито Х .: Роль развернутого белкового ответа в развитии центральной нервной системы. J Biochem. 2017; 162 (3): 155–62. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 16.Карагез Г.Е., Акоста-Альвеар Д., Вальтер П.: Развернутый белковый ответ: обнаружение и реагирование на колебания в способности эндоплазматического ретикулума к сворачиванию белков. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2019; 11 (9): pii: a033886. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | F1000 Рекомендация
  • 17. Кокс Дж. С., Уолтер П.: Новый механизм регуляции активности фактора транскрипции, который контролирует ответ развернутого белка. Ячейка. 1996; 87 (3): 391–404.PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 18. Калфон М., Цзэн Х., Урано Ф, и др. : IRE1 связывает нагрузку эндоплазматического ретикулума с секреторной способностью путем обработки мРНК XBP-1 . Природа. 2002; 415 (6867): 92–6. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | F1000 Рекомендация
  • 19. Йошида Х., Мацуи Т., Ямамото А, и др. : мРНК XBP1 индуцируется ATF6 и сплайсируется IRE1 в ответ на стресс ER с образованием высокоактивного фактора транскрипции. Ячейка. 2001; 107 (7): 881–91. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 20. Йошида Х., Хейз К., Янаги Х., и др. : Идентификация цис--действующего элемента стрессового ответа эндоплазматического ретикулума, ответственного за индукцию транскрипции регулируемых глюкозой белков млекопитающих. Участие основных факторов транскрипции лейциновой молнии. J. Biol Chem. 1998; 273 (50): 33741–9. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 21.Harding HP, Novoa I, Zhang Y, et al. : Регулируемая инициация трансляции контролирует стресс-индуцированную экспрессию гена в клетках млекопитающих. Mol Cell. 2000; 6 (5): 1099–108. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 22. Холлиен Дж., Лин Дж. Х., Ли Х., и др. : Регулируемый Ire1-зависимый распад информационных РНК в клетках млекопитающих. J. Cell Biol. 2009; 186 (3): 323–31. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 23.Холлиен Дж., Вайсман Дж. С.: Распад мРНК, локализованных в эндоплазматическом ретикулуме, во время развернутого белкового ответа. Наука. 2006; 313 (5783): 104–7. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | F1000 Рекомендация
  • 24. Harding HP, Zhang Y, Bertolotti A, et al. : Perk необходим для регуляции трансляции и выживания клеток во время развернутого белкового ответа. Mol Cell. 2000; 5 (5): 897–904. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 25.Мори К: Сигнальные пути в развернутом белковом ответе: развитие от дрожжей до млекопитающих. J Biochem. 2009; 146 (6): 743–50. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 26. Halbleib K, Pesek K, Covino R, et al. : Активация развернутого белкового ответа стрессом липидного бислоя. Mol Cell. 2017; 67 (4): 673–684.e8. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | F1000 Рекомендация
  • 27. Koh JH, Wang L, Beaudoin-Chabot C, et al.: IRE-1, активируемый стрессом липидного бислоя, модулирует аутофагию во время стресса эндоплазматического ретикулума. J Cell Sci. 2018; 131 (22): pii: jcs217992. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 28. Промлек Т., Ишивата-Кимата Ю., Шидо М., и др. : Аберрантность мембраны и развернутые белки по-разному активируют сенсор стресса эндоплазматического ретикулума Ire1. Mol Biol Cell. 2011; 22 (18): 3520–32. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 29.Volmer R, van der Ploeg K, Ron D: Насыщение мембранными липидами активирует преобразователи ответа развернутого белка в эндоплазматическом ретикулуме через их трансмембранные домены. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2013; 110 (12): 4628–33. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 30. Коно Н., Амин-Ветцель Н., Рон Д.: Общие свойства, связанные с охватом мембран, придают IRE1α чувствительность к мембранным аберрантам. Mol Biol Cell. 2017; 28 (17): 2318–32.PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 31. Tam AB, Roberts LS, Chandra V, et al. : Активатор UPR ATF6 реагирует на протеотоксический и липотоксический стресс различными механизмами. Dev Cell. 2018; 46 (3): 327–343.e7. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 32. Fun XH, Thibault G: Стресс липидного бислоя и вызванный протеотоксическим стрессом ответ развернутого белка задействуют различные транскрипционные и нетранскрипционные программы. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 2019; pii: S1388-1981 (19) 30062-9. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 33. Карагез Г.Е., Акоста-Альвеар Д., Нгуен Х.Т., и др. : индуцированный развернутым белком конформационный переключатель активирует IRE1 млекопитающих. eLife. 2017; 6 : pii: e30700. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 34. Ван П., Ли Дж., Тао Дж., и др. : Люминальный домен сенсорного белка ER стресса PERK связывает неправильно свернутые белки и тем самым запускает олигомеризацию PERK. J. Biol Chem. 2018; 293 (11): 4110–21. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 35. Далтон Р.П., Карагез Г.Е., Кахиапо Г., и др. : Обратная связь обонятельного и вомероназального рецепторов использует различные механизмы активации PERK. Biorxiv. 2018. Publisher Full Text
  • 36. Carrara M, Prischi F, Nowak PR, et al. : Неканоническое связывание домена АТФазы BiP с Ire1 и Perk диссоциирует с помощью развернутого белка C H 1, чтобы инициировать передачу сигналов стресса ER. eLife. 2015; 4 . PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 37. Каррара М., Приски Ф., Новак П.Р., и др. : Кристаллические структуры обнаруживают временную тетрамеризацию люминального домена PERK в передаче сигналов стресса эндоплазматического ретикулума. EMBO J. 2015; 34 (11): 1589–600. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 38. Amin-Wetzel N, Saunders RA, Kamphuis MJ, et al.: Ко-шаперон J-белка рекрутирует BiP для мономеризации IRE1 и подавления развернутого белкового ответа. Ячейка. 2017; 171 (7): 1625–1637.e13. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 39. Бертолотти А., Чжан Ю., Хендершот Л. М., и др. : Динамическое взаимодействие датчиков стресса BiP и ER в ответе развернутого белка. Nat Cell Biol. 2000; 2 (6): 326–32. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 40.Пинкус Д., Шевалье М.В., Арагон Т., и др. : Связывание BiP с сенсором ER-стресса Ire1 настраивает гомеостатическое поведение развернутого белкового ответа. PLoS Biol. 2010; 8 (7): e1000415. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 41. Окамура К., Кимата Ю., Хигашио Х., и др. : Диссоциация Kar2p / BiP от сенсорной молекулы ER, Ire1p, запускает ответ развернутого белка у дрожжей. Biochem Biophys Res Commun. 2000; 279 (2): 445–50. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 42. Элетто Д., Элетто Д., Дерш Д., и др. : Белковая дисульфидизомераза A6 контролирует распад передачи сигналов IRE1α посредством дисульфид-зависимой ассоциации. Mol Cell. 2014; 53 (4): 562–76. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 43. Элетто Д., Элетто Д., Бойл С., и др. : PDIA6 регулирует секрецию инсулина путем избирательного ингибирования активности RIDD IRE1. FASEB J. 2016; 30 (2): 653–65. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 44. Сепульведа Д., Рохас-Ривера Д., Родригес Д.А., et al. : Интерактомный скрининг определяет люминальный шаперон ER Hsp47 в качестве регулятора датчика IRE1α ответа развернутого белка. Mol Cell. 2018; 69 (2): 238–252.e7. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 45. Хун Ф., Лю Б., Ву Б.С., и др.: CNPY2 является ключевым инициатором пути PERK-CHOP ответа развернутого белка. Nat Struct Mol Biol. 2017; 24 (10): 834–9. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 46. Ван Кью, Гренендык Дж., Паскевичюс Т., и др. : два пула IRE1α в клетках сердечных и скелетных мышц. FASEB J. 2019; 33 (8): 8892–904. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 47. Йошида Х., Мацуи Т., Хосокава Н., и др.: Зависящий от времени фазовый сдвиг в ответе на развёрнутый белок у млекопитающих. Dev Cell. 2003; 4 (2): 265–71. PubMed Abstract
  • 48. Lin JH, Li H, Yasumura D, et al. : передача сигналов IRE1 влияет на судьбу клеток во время ответа развернутого белка. Наука. 2007; 318 (5852): 944–9. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 49. Ли Х., Коренных А.В., Берман С.Л., et al.: датчик стресса эндоплазматического ретикулума млекопитающих IRE1 передает сигналы посредством динамической кластеризации. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2010; 107 (37): 16113–8. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 50. Лу М., Лоуренс Д.А., Марстерс С., и др. : Противоположные сигналы ответа развернутого белка сходятся на рецепторе смерти 5, чтобы контролировать апоптоз. Наука. 2014; 345 (6192): 98–101. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 51.Haze K, Yoshida H, Yanagi H, et al. : Фактор транскрипции млекопитающих ATF6 синтезируется как трансмембранный белок и активируется протеолизом в ответ на стресс эндоплазматического ретикулума. Mol Biol Cell. 1999; 10 (11): 3787–99. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 52. Ye J, Rawson RB, Komuro R, et al. : ER стресс вызывает расщепление мембраносвязанного ATF6 теми же протеазами, которые обрабатывают SREBP. Mol Cell. 2000; 6 (6): 1355–64. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 53. Наданака С., Окада Т., Йошида Х., и др. : Роль дисульфидных мостиков, образованных в просветном домене ATF6, в ощущении стресса эндоплазматического ретикулума. Mol Cell Biol. 2007; 27 (3): 1027–43. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 54. Oka OBV, Lith M, Rudolf J, et al. : ERp18 регулирует активацию ATF6α во время ответа развернутого белка. EMBO J. 2019; 38 (15): PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 55. Палам LR, Бэрд Т.Д., Wek RC: Фосфорилирование eIF2 облегчает рибосомный обход ингибирующей восходящей ORF для усиления трансляции CHOP . J. Biol Chem. 2011; 286 (13): 10939–49. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Free Full Text
  • 56. Vattem KM, Wek RC: Реинициация с участием вышестоящих ORF регулирует трансляцию мРНК ATF4 в клетках млекопитающих. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2004; 101 (31): 11269–74. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 57. Лу П.Д., Хардинг Х.П., Рон Д. Повторная инициация трансляции в альтернативных открытых рамках считывания регулирует экспрессию генов в интегрированном стрессовом ответе. J. Cell Biol. 2004; 167 (1): 27–33. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 58. Jousse C, Bruhat A, Carraro V, et al. : ингибирование трансляции CHOP пептидом, кодируемым открытой рамкой считывания, локализованной в chop 5’UTR. Nucleic Acids Res. 2001; 29 (21): 4341–51. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 59. Harding HP, Zhang Y, Zeng H, et al. : интегрированная реакция на стресс регулирует метаболизм аминокислот и устойчивость к окислительному стрессу. Mol Cell. 2003; 11 (3): 619–33. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 60. Zinszner H, Kuroda M, Wang X, et al. : CHOP участвует в запрограммированной гибели клеток в ответ на нарушение функции эндоплазматического ретикулума. Genes Dev. 1998; 12 (7): 982–95. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 61. McCullough KD, Martindale JL, Klotz LO, et al. : Gadd153 сенсибилизирует клетки к стрессу эндоплазматического ретикулума, подавляя Bcl2 и нарушая окислительно-восстановительное состояние клеток. Mol Cell Biol. 2001; 21 (4): 1249–59. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 62. Майтин Э.В., Убеда М., Лин Дж. К., и др.: стресс-индуцируемый фактор транскрипции CHOP / gadd153 индуцирует апоптоз в клетках млекопитающих посредством зависимых и независимых от р38 киназы механизмов. Exp Cell Res. 2001; 267 (2): 193–204. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 63. Marciniak SJ, Yun CY, Oyadomari S, et al. : CHOP вызывает гибель, способствуя синтезу и окислению белка в эндоплазматическом ретикулуме, подвергающемся стрессу. Genes Dev. 2004; 18 (24): 3066–77. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 64.Чжоу Дж., Ван Дж., Шу XE, и др. : N 6 -Метиладенозиновые руководства по альтернативной трансляции мРНК во время интегрированного стрессового ответа. Mol Cell. 2018; 69 (4): 636–647.e7. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 65. Mendez AS, Alfaro J, Morales-Soto MA, et al. : Эндоплазматический ретикулум, независимая от стресса активация киназ, отвечающих за развернутый белок, с помощью небольшой молекулы, имитирующей АТФ. eLife. 2015; 4 . PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Free Full Text
  • 66. Коренных А.В., Егея П.Ф., Коростелев А.А., и др. : ответные сигналы развернутого белка через сборку Ire1 высокого порядка. Природа. 2009; 457 (7230): 687–93. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 67. Лу И, Лян Ф-Х, Ван Х: Подход синтетической биологии идентифицирует UPR РНК-лигазу RtcB млекопитающих. Mol Cell. 2014; 55 (5): 758–70. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 68. Космачевски С.Г., Эдвардс Т.Дж., Хан С.М., et al. : РНК-лигаза RtcB является важным компонентом развернутого белкового ответа многоклеточных животных. EMBO Rep. 2014; 15 (12): 1278–85. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 69. Юркин Дж., Хенкель Т., Нильсен А.Ф., et al.: комплекс тРНК-лигаза млекопитающих опосредует сплайсинг мРНК XBP1 и контролирует секрецию антител в плазматических клетках. EMBO J. 2014; 33 (24): 2922–36. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 70. Пешек Дж., Акоста-Альвеар Д., Мендез А.С., и др. : конформационная РНК-молния способствует выбрасыванию интрона во время нетрадиционного сплайсинга мРНК XBP1 . EMBO Rep. 2015; 16 (12): 1688–98.PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 71. Гонсалес Т.Н., Сидрауски С., Дёрфлер С., et al. : Механизм несплайсосомного сплайсинга мРНК в пути ответа развернутого белка. EMBO J. 1999; 18 (11): 3119–32. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 72. Unlu I, Lu Y, Wang X: Циклическая фосфодиэстераза CNP и РНКциклаза RtcA точно настраивают неканонический сплайсинг XBP1 во время стресса ER. J. Biol Chem. 2018; 293 (50): 19365–19376. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 73. Acosta-Alvear D, Karagöz GE, Fröhlich F, et al. : развернутый белковый ответ и механизмы нацеливания на белок эндоплазматического ретикулума сходятся на датчике стресса IRE1. eLife. 2018; 7 : pii: e43036. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 74.Бэ Д., Мур К.А., Мелла Дж. М., и др. : деградация мРНК Blos1 под действием IRE1 репозиционирует лизосомы и защищает клетки от стресса. J. Cell Biol. 2019; 218 (4): 1118–1127. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 75. Li W, Okreglak V, Peschek J, et al. : Разработка нестандартного сплайсинга мРНК, зависимого от ER-стресса. eLife. 2018; 7 : pii: e35388. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 76.Пламб Р., Чжан З.Р., Аппатурай С., и др. : функциональная связь между путём транслокационной транслокации белков и UPR. eLife. 2015; 4 : e07426. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 77. Сундарам А., Пламб Р., Аппатурай С., и др. : Транслокон Sec61 ограничивает передачу сигналов IRE1α во время ответа развернутого белка. eLife. 2017; 6 : pii: e27187. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 78.Адамсон Б., Норман Т.М., Йост М., и др. : платформа мультиплексного скрининга одиночных клеток CRISPR позволяет систематически анализировать развернутый белковый ответ. Ячейка. 2016; 167 (7): 1867–1882.e21. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 79. Адачи Ю., Ямамото К., Окада Т., и др. : ATF6 представляет собой фактор транскрипции, специализирующийся на регуляции белков контроля качества в эндоплазматическом ретикулуме. Cell Struct Funct. 2008; 33 (1): 75–89. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 80. Bommiasamy H, Back SH, Fagone P, et al. : ATF6alpha индуцирует XBP1-независимую экспансию эндоплазматического ретикулума. J Cell Sci. 2009; 122 (Pt 10): 1626–36. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 81. Sriburi R, Jackowski S, Mori K, et al. : XBP1: связь между развернутым белковым ответом, биосинтезом липидов и биогенезом эндоплазматического ретикулума. J. Cell Biol. 2004; 167 (1): 35–41. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | Рекомендация F1000
  • 82. Lee AH, Iwakoshi NN, Glimcher LH: XBP-1 регулирует подмножество генов-шаперонов, резидентов эндоплазматического ретикулума, в ответе на развернутый белок. Mol Cell Biol. 2003; 23 (21): 7448–59. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 83. Окада Т., Йошида Х., Акадзава Р., и др. : отчетливые роли активирующего фактора транскрипции 6 (ATF6) и двухцепочечной РНК-активируемой протеинкиназы-подобной киназы эндоплазматического ретикулума (PERK) в транскрипции во время ответа на развёрнутый белок млекопитающих. Biochem J. 2002; 366 (Pt 2): 585–94. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 84. Ямамото К., Сато Т., Мацуи Т., и др. : индукция транскрипции белков контроля качества ER млекопитающих опосредуется единичным или комбинированным действием ATF6alpha и XBP1. Dev Cell. 2007; 13 (3): 365–76. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 85. Йошида Х., Окада Т., Хейз К., и др. : ATF6, активированный протеолизом, связывается в присутствии NF-Y (CBF) непосредственно с цис-действующим элементом, ответственным за ответ на развёрнутый белок млекопитающих. Mol Cell Biol. 2000; 20 (18): 6755–67. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 86. Йошида Х., Окада Т., Хейз К., и др. : стресс-индуцированное эндоплазматическим ретикулумом образование комплекса факторов транскрипции ERSF, включающего NF-Y (CBF) и активирующие факторы транскрипции 6альфа и 6бета, которые активируют ответ развернутого белка млекопитающих. Mol Cell Biol. 2001; 21 (4): 1239–48. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 87.Йошида Х., Оку М., Сузуки М, и др. : pXBP1 (U), кодируемая в пре-мРНК XBP1, негативно регулирует активатор ответа развернутого белка pXBP1 (S) при стрессовом ответе ER млекопитающих. J. Cell Biol. 2006; 172 (4): 565–75. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 88. Yoshida H, Uemura A, Mori K: pXBP1 (U), негативный регулятор активатора ответа развернутого белка pXBP1 (S), нацеливается на ATF6, но не на ATF4 при деградации, опосредованной протеасомами. Cell Struct Funct. 2009; 34 (1): 1–10. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 89. Ямагути Х., Ван Х. Г.: CHOP участвует в индуцированном стрессом апоптоза эндоплазматического ретикулума, усиливая экспрессию DR5 в клетках карциномы человека. J. Biol Chem. 2004; 279 (44): 45495–502. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 90. Abdelrahim M, Newman K, Vanderlaag K, et al. : 3,3′-дииндолилметан (DIM) и его производные индуцируют апоптоз в раковых клетках поджелудочной железы через зависимую от стресса регуляцию DR5 эндоплазматического ретикулума. Канцерогенез. 2006; 27 : 717–28. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 91. Витале М., Бакунц А., Орси А., и др. : Недостаточная доступность BiP определяет стресс эндоплазматического ретикулума. eLife. 2019; 8 : pii: e41168. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 92. Финк Е.Е., Мопарти С., Багати А., и др. : Ось XBP1-KLF9 действует как молекулярный реостат для контроля перехода от адаптивного к цитотоксическому ответу развернутого белка. Cell Rep. 2018; 25 (1): 212–223.e4. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 93. Lerner AG, Upton JP, Praveen PVK, et al. : IRE1α индуцирует белок, взаимодействующий с тиоредоксином, чтобы активировать инфламмасому NLRP3 и способствовать запрограммированной гибели клеток при необратимом стрессе ER. Cell Metab. 2012; 16 (2): 250–64. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 94. Аптон Дж. П., Ван Л., Хань Д., и др.: IRE1α расщепляет выбранные микроРНК во время стресса ER для подавления трансляции проапоптотической каспазы-2. Наука. 2012; 338 (6108): 818–22. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 95. Sandow JJ, Dorstyn L., O’Reilly LA, et al. : ER стресс не вызывает повышенную регуляцию и активацию каспазы-2, чтобы инициировать апоптоз. Cell Death Differ. 2014; 21 (3): 475–80. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 96.Хан Д., Лернер А.Г., Ванде Валле Л., и др. : Режимы активации киназы IRE1альфа контролируют выход альтернативных эндорибонуклеаз для определения судьбы дивергентных клеток. Ячейка. 2009; 138 (3): 562–75. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 97. Lhomond S, Avril T., Dejeans N, et al. : Двойные функции РНКазы IRE1 определяют развитие глиобластомы. EMBO Mol Med. 2018; 10 (3): e7929. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 98.Чанг Т.К., Лоуренс Д.А., Лу М., и др. : Координация между двумя ветвями развернутого белкового ответа определяет судьбу апоптотической клетки. Mol Cell. 2018; 71 (4): 629–636.e5. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | F1000 Рекомендация
  • 99. Шеморри А., Харнос Дж. М., Гутман О., и др. : опосредованное каспазой расщепление IRE1 контролирует приверженность апоптотических клеток во время стресса эндоплазматического ретикулума. eLife. 2019; 8 : e47084.PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 100. Новоа И., Цзэн Х., Хардинг Х.П., et al. : подавление обратной связи ответа развернутого белка посредством GADD34-опосредованного дефосфорилирования eIF2alpha. J. Cell Biol. 2001; 153 (5): 1011–22. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Free Full Text
  • 101. Ma Y, Hendershot LM: Определение регуляторной петли отрицательной обратной связи, которая контролирует трансляцию белка во время стресса эндоплазматического ретикулума. J. Biol Chem. 2003; 278 (37): 34864–73. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 102. Gonen N, Sabath N, Burge CB, et al. : Широко распространенная PERK-зависимая репрессия мишеней ER в ответ на стресс ER. Sci Rep. 2019; 9 (1): 4330. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 103. Sun S, Shi G, Sha H, et al. : IRE1α является эндогенным субстратом деградации, связанной с эндоплазматическим ретикулумом. Nat Cell Biol. 2015; 17 (12): 1546–55. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 104. Хоримото С., Нинагава С., Окада Т., et al. : преобразователь ответа развернутого белка ATF6 представляет собой новый субстрат трансмембранного типа, связанный с эндоплазматической сеткой деградации, требующий как тримминга маннозы, так и белка SEL1L. J. Biol Chem. 2013; 288 (44): 31517–27. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 105.Чон Й.Дж., Ким Т., Пак Д., и др. : опосредованный miRNA дефицит TUSC3 увеличивает UPR и ERAD, способствуя метастатическому потенциалу NSCLC. Nat Commun. 2018; 9 (1): 5110. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 106. Zhu H, Bhatt B, Sivaprakasam S, et al. : Ufbp1 способствует развитию плазматических клеток и экспансии ER путем модуляции отдельных ветвей UPR. Nat Commun. 2019; 10 (1): 1084. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 107.Лю Дж, Ван И, Сонг Л, и др. : критическая роль DDRGK1 в гомеостазе эндоплазматического ретикулума посредством регуляции стабильности IRE1α. Nat Commun. 2017; 8 : 263. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 108. McMahon M, Samali A, Chevet E: Регулирование реакции развернутого белка некодирующей РНК. Am J Physiol Cell Physiol. 2017; 313 (3): C243 – C254. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 109.Каррерас-Суреда А., Джана Ф., Урра Н., и др. : Неканоническая функция IRE1α определяет состав эндоплазматического ретикулума, связанный с митохондриями, для контроля переноса кальция и биоэнергетики. Nat Cell Biol. 2019; 21 (6): 755–67. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | F1000 Рекомендация
  • 110. Сонг М., Сандовал Т.А., Чае С.С., и др. : IRE1α-XBP1 контролирует функцию Т-клеток при раке яичников, регулируя митохондриальную активность. Природа. 2018; 562 (7727): 423–428. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 111. Balsa E, Soustek MS, Thomas A, et al. : ER и стресс питательных веществ способствуют сборке суперкомплексов дыхательной цепи через ось PERK-eIF2α. Mol Cell. 2019; 74 (5): 877–890.e6. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 112. Лебо Дж., Сондерс Дж. М., Мораес VWR, et al.: Плечо PERK развернутого белкового ответа регулирует морфологию митохондрий во время острого стресса эндоплазматической сети. Cell Rep. 2018; 22 (11): 2827–2836. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 113. Коэн Н., Брекер М., Бакунц А., и др. : Железо влияет на склонность к кластеризации Ire1 и амплитуду передачи сигналов стресса эндоплазматического ретикулума. J Cell Sci. 2017; 130 (19): 3222–3233. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 114.Такеда К., Нагашима С., Шииба I, и др. : MITOL предотвращает апоптоз, вызванный стрессом ER, убиквитилированием IRE 1α в сайтах контакта ER-митохондрий. EMBO J. 2019; 38 (15): e100999. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 115. van Vliet AR, Giordano F, Gerlo S, et al. : Датчик стресса ER PERK координирует формирование сайта контакта с плазматической мембраной ER посредством взаимодействия с филамином-A и ремоделированием F-актина. Mol Cell. 2017; 65 (5): 885–899.e6. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 116. Urra H, Henriquez DR, Cánovas J, et al. : IRE1α управляет ремоделированием цитоскелета и миграцией клеток посредством прямого взаимодействия с филамином А. Nat Cell Biol. 2018; 20 (8): 942–53. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | F1000 Рекомендация
  • 117. Gallagher CM, Garri C, Cain EL, et al. : Цеапины представляют собой новый класс ингибиторов ответа развернутых белков, избирательно нацеленных на ветвь ATF6α. eLife. 2016; 5 : pii: e11878. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Free Full Text
  • 118. Gallagher CM, Walter P: Ceapins ингибируют передачу сигналов ATF6α, избирательно предотвращая транспорт ATF6α в аппарат Гольджи во время стресса ER. eLife. 2016; 5 : pii: e11880. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 119. Torres SE, Gallagher CM, Plate L, et al. : цеапины блокируют развернутый датчик ответа белка ATF6α, индуцируя неоморфную межорганическую связь. eLife. 2019; 8 : pii: e46595. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 120. Исикава Т., Кашима М., Нагано А.Дж., et al. : преобразователь ответа развернутого белка, опосредованная IRE1, передача сигналов, независимая от сплайсинга мРНК XBP1, не требуется для роста и развития рыб медака. eLife. 2017; 6 : pii: e26845. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 121.Чен X, Илиопулос Д., Чжан К., и др. : XBP1 способствует тройному отрицательному раку груди, контролируя путь HIF1α. Природа. 2014; 508 (7494): 103–7. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 122. Argemí J, Kress TR, Chang HCY, et al. : X-box Binding Protein 1 регулирует развернутый белок, острую фазу и реакцию на повреждение ДНК во время регенерации печени мыши. Гастроэнтерология. 2017; 152 (5): 1203–1216.e15. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 123. Rendleman J, Cheng Z, Maity S, et al. : Новое понимание клеточного временного ответа на протеостатический стресс. eLife. 2018; 7 : pii: e39054. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Free Full Text
  • 124. Taylor RC, Dillin A: XBP-1 является клеточно-неавтономным регулятором стрессоустойчивости и долголетия. Ячейка. 2013; 153 (7): 1435–47. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 125.Уильямс К.В., Лю Т., Конг Х, и др. : Xbp1s в нейронах Pomc связывает стресс ER с энергетическим балансом и гомеостазом глюкозы. Cell Metab. 2014; 20 (3): 471–82. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 126. Майло К., Мартин Дж., Себастьян Д., et al. : Циркадный и UPR-зависимый контроль CPEB4 опосредует трансляционный ответ для противодействия стеатозу печени при стрессе ER. Nat Cell Biol. 2017; 19 (2): 94–105. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 127. Zhu B, Zhang Q, Pan Y, et al. : 12-часовые часы у млекопитающих, автономных по клеткам, координируют метаболические и стрессовые ритмы. Cell Metab. 2017; 25 (6): 1305–1319.e9. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 128. Bu Y, Yoshida A, Chitnis N, et al. : ось PERK-miR-211 подавляет циркадные регуляторы и синтез белка, способствуя выживанию раковых клеток. Nat Cell Biol. 2018; 20 (1): 104–15. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 129. Gao L, Chen H, Li C, et al. : активация стресса ER нарушает экспрессию циркадных часов и генов, контролируемых часами, в клетках NIh4T3 через ATF4-зависимый механизм. Cell Signal. 2019; 57 : 89–101. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | F1000 Рекомендация
  • 130. Harnoss JM, Le Thomas A, Shemorry A, et al.: нарушение IRE1α через его киназный домен ослабляет множественную миелому. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2019; 116 (33): 16420–9. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 131. Туфанли О., Телкопаран Акиллилар П., Акоста-Альвеар Д., и др. : Нацеливание на IRE1 малых молекул противодействует прогрессированию атеросклероза. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2017; 114 (8): E1395 – E1404. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 132.Чопра С., Джованелли П., Альварадо-Васкес ПА, и др. : передача сигналов IRE1α-XBP1 в лейкоцитах контролирует биосинтез простагландинов и боль. Наука. 2019; 365 (6450): pii: eaau6499. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | F1000 Рекомендация
  • 133. Paxman R, Plate L, Blackwood EA, et al. : Фармакологические соединения, активирующие ATF6, метаболически активируются для селективной модификации белков эндоплазматического ретикулума. eLife. 2018; 7 : pii: e37168.PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 134. Табличка L, Кули С.Б., Чен Дж.Дж., и др. : низкомолекулярные регуляторы протеостаза, которые перепрограммируют ER для уменьшения агрегации внеклеточного белка. eLife. 2016; 5 : pii: e15550. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 135. Blackwood EA, Azizi K, Thuerauf DJ, et al. : Фармакологическая активация ATF6 обеспечивает глобальную защиту на широко распространенных моделях заболеваний путем репрограммирования клеточного протеостаза. Nat Commun. 2019; 10 (1): 187. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 136. Сидрауски С., Акоста-Альвеар Д., Хоуторский А., и др. : Фармакологическое торможение трансляции мРНК улучшает когнитивную память. eLife. 2013; 2 : e00498. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 137. Вонг Ю.Л., ЛеБон Л., Эдалджи Р., и др. : небольшая молекула ISRIB восстанавливает стабильность и активность мутантных комплексов eIF2B болезни исчезающего белого вещества. eLife. 2018; 7 : pii: e32733. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 138. Чоу А., Круковски К., Джопсон Т., и др. : Ингибирование интегрированной реакции на стресс устраняет когнитивный дефицит после черепно-мозговой травмы. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2017; 114 (31): E6420 – E6426. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 139. Кабир З.Д., Че А., Фишер Д.К., et al.: Спасение нарушенной коммуникабельности и тревожного поведения у взрослых мышей с дефицитом cacna1c путем фармакологического воздействия на eIF2α. Mol Psychiatry. 2017; 22 (8): 1096–109. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 140. Халлидей М., Рэдфорд Х., Секин Й., и др. : Частичное восстановление скорости синтеза белка с помощью небольшой молекулы ISRIB предотвращает нейродегенерацию без токсичности для поджелудочной железы. Cell Death Dis. 2015; 6 : e1672.PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 141. Das I, Krzyzosiak A, Schneider K, et al. : Предотвращение заболеваний протеостаза путем селективного ингибирования регуляторной субъединицы фосфатазы. Наука. 2015; 348 (6231): 239–42. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 142. Чен Й., Подожил Дж. Р., Кунжамма Р. Б., и др. : Sephin1, который продлевает интегрированную реакцию на стресс, является многообещающим терапевтическим средством при рассеянном склерозе. Мозг. 2019; 142 (2): 344–61. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 143. Каррара М., Сигурдардоттир А., Бертолотти А. Расшифровка избирательности голофосфатаз eIF2α и ингибиторов PPP1R15A. Nat Struct Mol Biol. 2017; 24 (9): 708–16. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 144. Бикнелл А.А., Бабур А., Федерович С.М., et al. : новая роль в цитокинезе обнаруживает вспомогательную функцию для развернутого белкового ответа. J. Cell Biol. 2007; 177 (6): 1017–27. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 145. Праманик Дж., Чен Х, Кар Г., и др. : полногеномный анализ показывает, что путь IRE1a-XBP1 способствует дифференцировке Т-хелперных клеток за счет разрешения секреторного стресса и ускорения пролиферации. Genome Med. 2018; 10 (1): 76. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация
  • 146. Брюер Дж. У., Дил Дж. А. PERK опосредует выход из клеточного цикла во время ответа на развёрнутый белок млекопитающих. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2000; 97 (23): 12625–30. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 147. Hamanaka RB, Bennett BS, Cullinan SB, et al. : PERK и GCN2 способствуют фосфорилированию eIF2alpha и остановке клеточного цикла после активации пути ответа развернутого белка. Mol Biol Cell. 2005; 16 (12): 5493–501. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 148. Хуанг Ц., Ву С., Джи Х., и др.: Идентификация XBP1-u как нового регулятора оси MDM2 / p53 с использованием библиотеки shRNA. Sci Adv. 2017; 3 (10): e1701383. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст | F1000 Рекомендация

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *