Регенерация арагон ж био: Регенерация картриджа Арагон

Картридж Арагон-Ж Био

Арагон Ж БИО —

отличительные особенности от Арагон 2 :

Картридж Арагон-БИО содержит биоцидную добавку, которая во взаимодействии с материалом Арагон и при сохранении в картридже серебра в несмываемой форме, создает тройную гарантию защиты от вирусов и бактерий.

В картридже Арагон-БИО существенно снижены размеры микроглобул, что позволяет значительно увеличить электрокинетический потенциал сорбента, за счет увеличения поверхности соприкосновения.

В картридже Арагон-БИО применена технология монодисперсного распределения пор полимера, что увеличивает гарантии задержания любых загрязнений во всем объеме картриджа и сохранение высоких характеристик очистки на всем протяжении ресурса.

1.Уникальный уровень очистки от всех вредных примесей, включая вирусы гепатита А, ротавирусы.

2.Умягчение воды и обогащение ее природной легкоусвояемой формой кальция – арагонитом.
3.Полная защита от солей жесткости, выпадающих в виде накипи( квазумягчение).

4.Удаление растворенного железа.

5.Невозможность проникновения отфильтрованной грязи обратно в воду — барьерная функция. (АНТИСБРОС)

6.Защита серебром в несмываемой форме от размножения бактерий внутри фильтра.

7.Одновременная очистка воды сразу тремя методами: сорбция, ионный обмен, механическая очистка.

8.У фильтров Гейзер ресурс по хлору не ограничен и эффективность очистки близка к 100 % .

9.Возможность полного многократного восстановления всех фильтрующих свойств материала АРАГОН путем простой регенерации в домашних условиях, что существенно сэкономит ваши деньги. Вода, очищенная АРАГОНОМ, становится не только идеально чистой, но и полезной для здоровья.

10. Общие характеристики: вода, насыщенная арагонитом не образует при нагревании прочного осадка в виде накипи, а имеющийся на стенках посуды – разрушается. Наличие в составе фильтроматериала ионообменной смолы значительно увеличивает ресурс и эффективность удаления таких вредных для человека примесей как марганец, железо (в том числе и коллоидное) и тяжелых металлов ( кадмий, свинец и др.).

Ресурс : 7000л ( 25000л после многократных регенераций, но исчезнет биоцидная добавка)

t воды : до 95С

Арагон Ж Био входит в заводскую комплектацию фильтров : Био 321, Био 322, Био 331, Био 332, Био 341.

Картридж Арагон Ж Био взаимозаменяем с картриджами Арагон 2 и Арагон Ж Био.

Арагон регенерация, картридж Арагон, Арагон-2, Гейзер фильтр

Регенерация картриджей Арагон:  Арагон-М, Арагон-Ж, Арагон-2

Если в течение работы вашего фильтра, давление воды на выходе из него стало значительно ниже, или же крайне слабым, и это никак не связано с общим давлением воды в системе, значит пришла пора регенерировать элемент, который несёт на себе основную нагрузку по химической очистке — Арагон.  Засорение картриджа может произойти по двум причинам. а) из-за слишком сильной механической загрязнённости системы б) из-за наличия в воде большого количества растворённого железа. Чаще всего механически картридж забивается  на верхнем уровне, и для прочистки, обычно, бывает достаточно почистить его поверхность под струей горячей воды, губкой для мытья посуды с жёстким основанием (не металлическим).

Если причина засорения была чисто механическая, то проведенной процедуры будет достаточно и напор восстановится. Если напор не восстановился, то необходимо сделать регенерацию от растворенного железа.

(п.1) Если причиной послужило растворенное железо, то дополнительно нужно провести следующие мероприятия: Перед регенерацией, если картридж Арагон имеет внутреннюю вставку, её нужно извлечь, открутив донную заглушку (специальным ключиком, входит в комплект поставки)  и вытолкнуть пальцем из фильтропатрона. Донную заглушку поставить на место. Приготовить  водный раствор (40 гр. лимонной кислоты на 1 литр воды).  Отдельно раствор соды (примерно 2 чайные ложки на 1 литр воды). Способ регенерации подходит для картриджей Арагон, Арагон-Ж, Арагон-М, Арагон-2.

(п.2) В случае, если причиной снижения работоспособности картриджа Арагон стали избыточные  соли жесткости, тогда нужно выполнить все вышеуказанные действия (п.1) и приготовить  следующий раствор: 40-45 г. лимонной кислоты и 40 г. соды (2 столовые ложки) аккуратно растворить в 2-х литровой банке с водой. (подходит для картриджей Арагон, Арагон-Ж, Арагон-М, Арагон-2)

Внимание:

Строго придерживаться указанных дозировок для приготовления регенерационных растворов!!! При использовании чрезмерного количества составляющих веществ (на глазок), может случиться растрескивание материала Арагонов и  разрушение смолы в Арагоне-2. 

Картридж поставить резьбой вверх в стакан от корпуса фильтра перед собой. Аккуратно залить приготовленный раствор в отверстие картриджа в несколько приёмов, т.к. в связи с химической реакцией, происходящей внутри элемента (при смешивании лимонки и соды), активное вспенивание (выделение углекислого газа) может привести к переливанию раствора через край. Раствор должен заполнить внутреннюю полость картриджа и пространство между корпусом и картриджем до верха. В таком виде рекомендуется оставить элемент на ночь (часов на 8-10), но можно и не оставлять, а проделать всю процедуру в один прием.

В таком случае картридж устанавливается не в стакан от фильтра, а в обычный тазик или подходящую посуду, чтобы при проливании, вода из картриджа могла выходить во внешнюю среду через поверхность картриджа. Картридж проливается с двух сторон, пока не используется весь раствор. При первичном проливании, промывается нижняя часть картриджа, так как давление создается, именно внизу. Для того, чтобы промыть верхнюю часть фильтропатрона, нужно перевернуть его вверх дном, и специальным ключиком  (поставляется в наборе с фильтром) открутить донную заглушку. Нижний край с резьбой плотно закрыть полиэтиленом и обмотать нитками или шнурком для герметичности. Таким образом, заливая раствор с другой стороны отрегенерировать оставшуюся часть картриджа. (принцип регенерации смотрите на видео ниже).

—

Для проведения регенерации только от солей железа (п.1),  раствор в колбе на ночь оставлять не нужно, а пролить, с двух сторон, до тех пор, пока вода, выходящая из картриджа, не станет чистой и прозрачной.  

После этого залить в горловину картриджа приготовленный раствор соды и оставить на 1 час. Перед тем, как заливать раствор соды, попробуйте, продувается ли ваш картридж. Это можно сделать большой грушей, или в отсутствие таковой, просто дунуть ртом в отверстие картриджа. Если картридж продувается, то все в порядке, можно завершать регенерацию раствором соды.

Если же вы обнаружили, что элемент не продувается, значит регенерация не была успешной. В таком случае, если вы планируете еще какое то время поработать на этом картридже, можно попробовать прокипятить Арагон (Арагон М, Арагон Ж,) (Арагон-2 кипятить НЕЛЬЗЯ ) в растворе лимонной кислоты.  Для этого погрузить Арагон в кастрюлю с раствором, указанным в (п.1)  и прокипятите  минут 30-40. После этого продуйте снова. Затем восстановите кислотно-щелочной баланс раствором соды, как описано выше в (п.1)

 ПОСЛЕ ПРОВЕДЕНИЯ РЕГЕНЕРАЦИИ:

После того, как регенерация будет выполнена для (п.1) и (п.2), картридж вынуть из корпуса-стакана и дать стечь раствору. Оставшийся в банке раствор пролить через картридж. Затем промыть картридж с двух сторон обычной водой. Для того, чтобы промыть верхнюю часть фильтропатрона, нужно перевернуть его вверх дном, закрыть полиэтиленом резьбовое крепление, имитируя стакан, и заливая чистую воду, промыть остальную часть картриджа. После этого элемент вкрутить в корпус фильтра.

—

На видео представлен МАНУАЛ регенерации Арагона (Арагона-Ж) по жесткости, насыщенным раствором соли. 

(п.3) Для этого метода нужно приготовить: насыщенный раствор соли . Для лучшего растворения можно использовать горячую воду. Раствор нужно делать, постепенно добавляя в воду по ст.ложке соли и размешивать до растворения. Когда раствор насытится, то соль больше растворяться не будет и выпадет в осадок (это примерно, 800 гр. соли на 3 литра воды). Раствор аккуратно перелить в другую емкость, чтобы не взболтать осадок. После проведения регенерации, картридж промыть чистой водой для удаления соленого привкуса и вкрутить в фильтр.

—

Принцип проведения регенерации 

одинаковый для всех трех методов.

Дополнительно о способах регенерации картриджей Арагон смотрите в новой статье:

————————————

Похожие статьи

Гейзер фильтры, Арагон-2, Регенерация, жесткость

Если вы обладатель фильтра Гейзер 3ИВС или 1Севро, в комплектации  которых присутствует картридж Арагон-2, то у вас есть дополнительная возможность регенерировать картридж Арагон-2 не только от механических примесей или от  растворённого железа, но и от солей жёсткости.

Состав картриджа Арагон-2 включает в себя не только полимер ПГС (пространственно-глобулярной структуры), но и впаянную в структуру ПГС  ионообменную смолу.  За счёт этого ваш фильтропатрон не только делает комплексную очистку воды наравне с угольными сорбентами, но и задерживает соли жёсткости, что не под силу картриджам на активированных углях. 

Признаком к регенерации картриджа Арагон-2 служит появление в воде после кипячения белого осадка. Это говорит о том, что причиной снижения работоспособности картриджа Арагон-2 стали избыточные соли жесткости.

Регенерация картриджа Арагон-2 по жесткости:

Чтобы провести регенерацию Арагона-2 по жесткости, сначала  нужно  выкрутить из фильтра колбу с картриджем (на колбе с Арагоном  есть надпись «тонкая очистка»). Колбу хорошо помыть с мылом и прополоскать.  Поверхность картриджа почистить под струей горячей воды, губкой для мытья посуды с жёстким основанием (не металлическим) и приготовить  следующий раствор:  

40-45 г. лимонной кислоты и 40 г. соды (2 столовые ложки) аккуратно растворить в 2-х литровой банке с водой.

—

Картридж поставить резьбой вверх в колбу (которую мы помыли)  перед собой. Аккуратно залить приготовленный раствор в отверстие картриджа в несколько приёмов, т.к. в связи с химической реакцией, при смешивании лимонки и соды, активное вспенивание (выделение углекислого газа) может привести к переливанию раствора через край. Раствор должен заполнить картридж изнутри и пространство между корпусом и картриджем, и быть вверху на одном уровне.  В таком виде нужно оставить элемент на ночь (часов на 8-10).

—

После определенного времени картридж вынуть из колбы и дать стечь раствору. Оставшийся в банке раствор пролить через картридж. Затем  картридж нужно промыть. Для этого залейте чистую воду  в картридж и подождите пока она выйдет из него. Таким образом вы промоете нижнюю часть картриджа, ту где создается давление от залитой воды. Для того, чтобы промыть верхнюю часть картриджа, нужно перевернуть его вверх дном, и специальным ключиком  (поставляется в наборе с фильтром) открутить донную заглушку. Край с резьбой плотно закрыть полиэтиленом и обмотать нитками или шнурком для герметичности. Таким образом, заливая с другой стороны чистую воду, промыть остальную часть картриджа. После этого элемент вкрутить в корпус фильтра.

 —

Ниже описан еще один способ регенерации от солей жесткости для Арагона-Ж:

—
Приготавливаем насыщенный раствор соли (на  3-х литровую банку нужно примерно 600-700  гр. соли). Картридж выкручиваем из корпуса, и месте с колбой, в которой он находится, ставим перед собой. (Предварительно картридж промыть под струей горячей воды, используя губку для мытья посуды с жёстким основанием, но не металлическую. Воду с колбы слить и колбу вымыть. Вставить картридж в чистую колбу резьбой вверх. Заливаем в отверстие фильтра  раствор, который мы сделали в банке, до верха. Из нижней половины картриджа вода будет вытекать небольшими порциями. Таким образом выливаем половину раствора из банки.  На этом этапе легко проверить, что происходит регенерация. Пробуем на вкус воду в банке (очень солёная), и пробуем воду, которая выходит из картриджа (вода не имеет вкуса). Это говорит о том, что то к чему мы стремимся достигается путем регенерации. А именно: ионы кальция и магния, которыми насыщен ваш фильтропатрон, уступают место ионам натрия, которые находятся в растворе соли.

—
Мы с вами отрегенерировали только нижнюю часть картриджа. Теперь перевернём его «вверх ногами», открутим донную заглушку (ключик поставляется в комплекте), а край, который имеет резьбу, плотно закроем полиэтиленовым пакетом и закрепим резинкой. Теперь, оставшуюся часть раствора проливаем в картридж с другой стороны.

После этого картридж промываем чистой водой ( сразу же, не оставляя на потом) в течение 3-5 минут для удаления солёного привкуса и вставляем в корпус фильтра.

Таким образом ваш картридж снова готов к работе по удалению солей жёсткости.

—
Принцип регенерации можно посмотреть на видео внизу страницы:

Похожие статьи

Ионообменный картридж Арагон — Ж БИО

Арагон — Ж БИО —  модификация картриджа Арагон  БИО для жёсткой воды. Арагон БИО — это уникальная разработка специалистов компании Гейзер. Арагон БИО полностью удаляет из воды все вирусы и бактерии. Это  Единственный в России картридж, получивший сертификат по системе ГОСТ Р на употребление очищенной воды без кипячения. ГОСТ Р 51232-98 (Вода питьевая) . ГОСТ Р 51871-02 (Устройства водоочистные). СанПиН 2.1.4.1074 (Вода питьевая).
Серебро в несмываемой форме в сочетании с материалом арагон обеспечивают нажёжную защиту от бактерий и вирусов.
В картридже Арагон БИО значительно снижены размеры микроглобул, что увеличивает поверхность соприкосновения фильтрующего материала с водой  и что значительно улучшает сорбционную(впитывающую) способность материала.
В картридже Арагон-БИО применена технология монодисперсного(равномерного) распределения пор полимера, что увеличивает гарантии  задержания  любых загрязнений во всем объеме картриджа и сохранение  высоких характеристик очистки на всем протяжении ресурса.
При окончании ресурса картриджа значительно снижается напор. Это уникальное свойство материала Арагон позволяет  всегда своевременно производить замену картриджа.

Система антисброс: очищенные загрязнения никогда не попадут в очищенную воду, благодаря сложной лабиринтной структуре фильтроматериала.
Арагон можно регенерировать в домашних условиях, что значительно увеличивает его ресурс.
Используется в трёхступенчатых системах очистки жёсткой  воды Гейзер БИО.

Технические характеристики:

Температура очищаемой воды:  4-95 °С

Типоразмер: 10SL (резьба)

Производительность: 2-5 литров/мин.

Пористость:  0,05 — 0,1 мкм

РЕГЕНЕРАЦИЯ АРАГОН

МЕХАНИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА. ЗАМЕНА ДОЗАТОРА

1. Раскрутить входящим в комплект поставки ключом второй корпус и вывернуть картридж Арагон.
2. Вылить из него воду (у Арагон-М специальным ключом вывернуть донную заглушку, извлечь при необходимости дозатор, ввернуть заглушку до упора) и очистить внешнюю поверхность картриджа мягкой щеткой (например платяной) под струей воды. При замене картриджа Арагон достать из использованного картриджа вставку В и переставить в новый картридж, снять крышку нового дозатора, вставить его открытой стороной вверх и ввернуть донную заглушку до упора.
3. Собрать фильтр в обратном порядке и промыть его 1-2 минуты.
4. Фильтр готов к работе.

* У Арагон-М специальным ключом вывернуть донную заглушку, извлечь и заменить при необходимости дозатор, ввернуть заглушку до упора.

ОЧИСТКА ОТ СОЛЕЙ ЖЕЛЕЗА (ПРОВОДИТСЯ ПОСЛЕ МЕХАНИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ)

1. В эмалированной или стеклянной посуде приготовить 3 литра горячего 3% раствора лимонной кислоты (40 г. или 2 столовые ложки на литр воды).
2. Поставить картридж в мойку или соответствующую емкость на подставку и проливать через него приготовленный раствор, заливая его внутрь картриджа Арагон через резьбовую горловину порциями до самого верха до тех пор, пока выходящий из него раствор не станет чистым и прозрачным.
3. Приготовить 0.6л 2% раствора питьевой соды (1 чайная ложка соды на 0.6 л).
4. Установить картридж Арагон в корпус и залить внутрь раствор соды. Заливать раствор нужно через горловину картриджа до тех пор, пока он весь и корпус не заполнятся раствором.
5. Через час вылить раствор и собрать фильтр в обратном порядке.* Открыть кран чистой воды и пролить воду в течение 5 минут.
6. Фильтр готов к работе.

* Перед сборкой смажьте уплотнительное кольцо (рис. 2 поз. 6) вазелином или силиконовой смазкой (не путать с герметиком!).

ОЧИСТКА ОТ СОЛЕЙ ЖЕСТКОСТИ (ПРОВОДИТСЯ ПОСЛЕ МЕХАНИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ)

1. Приготовить раствор для регенерации. В емкость 1,5-2 л насыпать 40 г лимонной кислоты, 30 г (2 чайные ложки) соды и залить 1 л воды. Заливать воду следует в несколько приемов, поскольку при этом происходит вспенивание (выделение углекислого газа).
2. Установить картридж в корпус и полностью залить его приготовленным раствором (примерно 0,6 л).
3. Оставить на 10-12 часов , после чего вынуть картридж и вылить отработанный раствор.
4. Поставить картридж вертикально в мойку и пролить через него оставшийся раствор, заливая внутрь через резьбовую горловину и дать полностью стечь.
5. Вымыть водой остатки раствора из картриджа в два этапа. Сначала 3 литра воды залить порциями до самого верха картриджа через резьбовую горловину. Затем обернуть горловину полиэтиленовой пленкой и закрепить её резинкой или бечевкой.
6. Перевернуть и выкрутить соответствующим ключом донную заглушку.
7. Поставить в мойку в этом положении вертикально и пролить ещё 3 литра воды как описано выше.
8. Снять пленку и ввернуть на место донную заглушку.
9. Собрать фильтр в обратном порядке.
10. Открыть кран для чистой воды и промыть фильтр водой со скоростью 1-1,5 л/мин в течение 3 мин.
11. Фильтр готов к работе.

Очистка и регенерация картриджа арагон

Инструкция по регенерации картриджа Гейзер «Арагон»

Раскрутить входящим в комплект поставки ключом первый корпус и вывернуть картридж. Вылить из него воду. Очистить внешнюю поверхность картриджа мягкой щеткой (например, платяной) под струей воды.

Ключом донной заглушки вывернуть у картриджа донную заглушку (рис. 1) и вынуть использованный дозатор (рис. 2).
При замене картриджа Арагон на новый, перед установкой дозатора вынуть из верхней части использованного картриджа ограничивающую пластиковую вставку В и установить ее в новый (рис. 3).
Снять крышку с нового дозатора и вставить его открытой стороной вверх. Ввернуть донную заглушку. Собрать фильтр в обратном порядке и промыть его 1-2 минуты.

Регенерация (проводится после механической очистки)

Приготовить раствор для регенерации. В емкость 1,5-2 л насыпать 40 г лимонной кислоты, 40 г (2 столовые ложки) соды и залить 1 л воды. Заливать воду следует в несколько приемов, поскольку при этом происходит вспенивание (выделение углекислого газа). Установить картридж в корпус и полностью залить его приготовленным раствором (примерно 0,6 л). Оставить на 10-12 часов, после чего вынуть картридж и вылить отработанный раствор.

Поставить картридж вертикально в мойку и пролить оставшийся раствор, заливая внутрь через резьбовую горловину и дать полностью стечь. Вымыть водой остатки раствора из картриджа в два этапа. Сначала 3 литра воды залить порциями до самого верха картриджа через резьбовую горловину. Затем обернуть горловину полиэтиленовой пленкой и закрепить ее резинкой или бечевкой. Перевернуть и выкрутить соответствующим ключом донную заглушку. Поставить в мойку в этом положении вертикально и пролить еще 3 литра воды, как описано выше.
Снять пленку и ввернуть на место донную заглушку. Собрать фильтр в обратном порядке. Открыть кран чистой воды и промыть фильтр со скоростью 1-1,5л/мин в течение 3 мин.

Регенерация фильтра Гейзер Арагон

Арагон – картридж для очистки горячей и холодной воды, который отличается от других картриджей своими возможностями. Фильтры Арагон не только очищают воду от механических частиц и микроорганизмов, они могут также улавливать растворённые в воде химические примеси вроде хлора. А ещё у этих фильтров есть одно очень важное для потребителя свойство – несмотря на то, что эти картриджи и без того не слишком дороги, вы можете запросто увеличить их срок службы, ведь их можно почистить самостоятельно в домашних условиях!

Очистка картриджа называется регенерацией. Регенерация картриджа Арагон – это вполне посильная задача для любого человека. Этот способ продления жизненного цикла картриджа подходит практически для всех имеющихся модификаций: сменных фильтров для насадок на кран, картриджей Арагон Стандарт, Арагон Эко и Арагон Био. Впрочем, регенерация фильтра Гейзер Арагон Био заключается только в механической чистке – химическая чистка ему противопоказана.

Когда нужно чистить картридж Арагон? Когда в кране упадёт давление воды. Если ресурс картриджа ещё не выработан, значит, можно его почистить.

Регенерация картриджей Арагон (кроме Арагон Био) состоит из двух этапов: механической чистки и химической очистки от солей. Что же нужно сделать?

Для начала нужно вынуть картридж из фильтра. Раскрутите фильтр при помощи специального ключа и извлеките из корпуса картридж. Некоторые картриджи выкручиваются, а некоторые просто вынимаются. У картриджей, которые вынимаются, с обеих сторон есть резиновые прокладки. Их тоже нужно снять.

Теперь из картриджа нужно вылить всю воду. Если у вас картридж со вставкой, вставку можно заменить. Внешнюю поверхность картриджа почистите мягкой щёткой. Для этих целей подходят обычные платяные щётки. Очищая картридж Арагон, обмывайте его под струёй проточной воды.

Теперь, когда картридж очищен, заново соберите его. Чтобы приготовить его к работе (если чистку от солей вы проводить не будете), установите фильтр на место и промойте его, включив воду на 1-2 минуты.

Чистка картриджа Арагон от солей производится с помощью обычной лимонной кислоты и соды, которые есть у любой хорошей хозяйки. Кроме того, вам понадобится высокая ёмкость, в которую картридж можно было бы окунуть «с головой».

Для очистки от солей железа вам понадобится следующий раствор: на 1 литр воды возьмите 30 г лимонной кислоты (1,5 столовых ложки). Чтобы приготовить раствор, воду вскипятите, а затем засыпьте лимонную кислоту.

Хорошо размешайте раствор, чтобы лимонная кислота растворилась полностью. Когда раствор чуть остынет, погрузите в него картридж полностью. В таком положении картридж Арагон нужно оставить на длительное время (например, на ночь).

Теперь, когда картридж отмок, его нужно промыть. Раствор разогрейте до 80 градусов (чтобы в нём образовались пузырьки), и потом, плотно закупорив одно из отверстий, пролейте через картридж 1,5 литра горячего раствора, чтобы из него вымылись соли. Делать это лучше над тазом. Картридж заливайте до самого верха, а потом ожидайте, пока раствор не выйдет через его боковые отверстия. Затем повторите то же самое, закупорив второе отверстие картриджа. Не обожгитесь!

Теперь нужно прочистить картридж Арагон другим раствором – содовым. Сода растворяет соли жёсткости, которые не берёт лимонная кислота. Для приготовления раствора вам понадобится на каждый литр воды 50 г соды (2-3 столовых ложки).

Чтобы приготовить раствор, воду вскипятите и добавьте в неё соду. Осторожно! Сода вызывает очень бурную реакцию. Чтобы не обжечься, приготовьте для раствора такую ёмкость, чтобы раствор не доставал до её края. Когда раствор остынет (рука должна терпеть), залейте им картридж Арагон и оставьте на ночь.

После выдержки вам нужно снова собрать фильтр. Установите его на место, откройте воду, и пусть она льётся минут 5 (для размера 10SL) или 30 (для размеров 10ВВ и 20ВВ) со скоростью не менее 1-1,5 литров в минуту.

Вот и всё! Вы прекрасно справились с регенерацией картриджей!

Ионообменный картридж Арагон 2

Арагон 2   —  ионообменный картридж с повышенным ресурсом по солям жёсткости.  Композитный материал, на основе материала Арагон и ионообменной смолы, с увеличенным ресурсом и эффективностью удаления солей жесткости, марганца, железа (растворенного и коллоидного) и тяжелых металлов (кадмий, свинец и др.). Примерное соотношение полимера Арагон к ионообменной смоле составляет 1:1. Это позволило увеличить ресурс по удалению солей жесткости картриджем Арагон 2 в 12-15 раз по сравнению с Арагоном Ж. Одновременно в картридже работает эффект квазиумягчения.

Фильтроматериал Арагон – уникальный полимер комбинированного действия, производящий микроглобулярную очистку. Он задерживает самые мелкие механические частицы и удаляет растворенные химические примеси, благодаря своей сложной структуре, механизму сорбции и ионному обмену.
Арагон полностью удаляет из воды все бактерии и вирусы, включая гепатит А, норовирусы и ротавирусы.  Дополнительная бактериостатическая защита достигается путем введения в полимер по особой технологии серебра в металлической, несмываемой форме.

При окончании ресурса картриджа значительно снижается напор. Это уникальное свойство материала Арагон позволяет  всегда своевременно производить замену картриджа.

Система антисброс: очищенные загрязнения никогда не попадут в очищенную воду, благодаря сложной лабиринтной структуре фильтроматериала.

Арагон можно регенерировать в домашних условиях, что значительно увеличивает его ресурс.

Используется в трёхступенчатых системах очистки жёсткой  воды производства Гейзер.

Технические характеристики:

Температура очищаемой воды:  4-95 °С

Типоразмер: 10SL (резьба)

Производительность: 6-15 литров/мин.

Пористость:  0,1 — 1 мкм

РЕГЕНЕРАЦИЯ АРАГОН

МЕХАНИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА. ЗАМЕНА ДОЗАТОРА

1. Раскрутить входящим в комплект поставки ключом второй корпус и вывернуть картридж Арагон.
2. Вылить из него воду (у Арагон-М специальным ключом вывернуть донную заглушку, извлечь при необходимости дозатор, ввернуть заглушку до упора) и очистить внешнюю поверхность картриджа мягкой щеткой (например платяной) под струей воды. При замене картриджа Арагон достать из использованного картриджа вставку В и переставить в новый картридж, снять крышку нового дозатора, вставить его открытой стороной вверх и ввернуть донную заглушку до упора.
3. Собрать фильтр в обратном порядке и промыть его 1-2 минуты.
4. Фильтр готов к работе.

* У Арагон-М специальным ключом вывернуть донную заглушку, извлечь и заменить при необходимости дозатор, ввернуть заглушку до упора.

ОЧИСТКА ОТ СОЛЕЙ ЖЕЛЕЗА (ПРОВОДИТСЯ ПОСЛЕ МЕХАНИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ)

1. В эмалированной или стеклянной посуде приготовить 3 литра горячего 3% раствора лимонной кислоты (40 г. или 2 столовые ложки на литр воды).
2. Поставить картридж в мойку или соответствующую емкость на подставку и проливать через него приготовленный раствор, заливая его внутрь картриджа Арагон через резьбовую горловину порциями до самого верха до тех пор, пока выходящий из него раствор не станет чистым и прозрачным.
3. Приготовить 0.6л 2% раствора питьевой соды (1 чайная ложка соды на 0.6 л).
4. Установить картридж Арагон в корпус и залить внутрь раствор соды. Заливать раствор нужно через горловину картриджа до тех пор, пока он весь и корпус не заполнятся раствором.
5. Через час вылить раствор и собрать фильтр в обратном порядке.* Открыть кран чистой воды и пролить воду в течение 5 минут.
6. Фильтр готов к работе.

* Перед сборкой смажьте уплотнительное кольцо (рис. 2 поз. 6) вазелином или силиконовой смазкой (не путать с герметиком!).

ОЧИСТКА ОТ СОЛЕЙ ЖЕСТКОСТИ (ПРОВОДИТСЯ ПОСЛЕ МЕХАНИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ)

1. Приготовить раствор для регенерации. В емкость 1,5-2 л насыпать 40 г лимонной кислоты, 30 г (2 чайные ложки) соды и залить 1 л воды. Заливать воду следует в несколько приемов, поскольку при этом происходит вспенивание (выделение углекислого газа).
2. Установить картридж в корпус и полностью залить его приготовленным раствором (примерно 0,6 л).
3. Оставить на 10-12 часов , после чего вынуть картридж и вылить отработанный раствор.
4. Поставить картридж вертикально в мойку и пролить через него оставшийся раствор, заливая внутрь через резьбовую горловину и дать полностью стечь.
5. Вымыть водой остатки раствора из картриджа в два этапа. Сначала 3 литра воды залить порциями до самого верха картриджа через резьбовую горловину. Затем обернуть горловину полиэтиленовой пленкой и закрепить её резинкой или бечевкой.
6. Перевернуть и выкрутить соответствующим ключом донную заглушку.
7. Поставить в мойку в этом положении вертикально и пролить ещё 3 литра воды как описано выше.
8. Снять пленку и ввернуть на место донную заглушку.
9. Собрать фильтр в обратном порядке.
10. Открыть кран для чистой воды и промыть фильтр водой со скоростью 1-1,5 л/мин в течение 3 мин.
11. Фильтр готов к работе.

Регенерация костей: текущие концепции и будущие направления | BMC Medicine

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г.,
  браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie
потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

регенерации | Альфа памяти | Фэндом

Восстановление представляло собой процесс ремонта или обновления.Восстановление поврежденных тканей было важной областью медицины. Кроме того, регенерация была естественной деятельностью, предпринимаемой некоторыми видами во время цикла отдыха, аналогичной сну.

Применение в медицине

Эта статья или раздел неполные
На этой странице отсутствуют существенные детали, и требует внимания . Информацию о требованиях к расширению можно найти на странице обсуждения статьи. Не стесняйтесь редактировать эту страницу, чтобы помочь с этим расширением.

В 2377 году Доктор нашел способ адаптировать методы регенерации Борга для лечения острой субклеточной деградации доктора Льюиса Циммермана. (ВОЙ: «Линия жизни»)

Естественное использование

Voyager , помогающий в регенерации

Нуклеогенное облако, с которым столкнулся USS Voyager в 2371 в Дельта-квадранте, обладало способностью к регенерации. Чтобы помочь этому процессу регенерации, «Вояджер » передал нуклонный луч в форму жизни.(ВОЙ: «Облако»)

Борг

дронов боргов восстановлено в нишах боргов. Эти альковы были найдены на борту судов Боргов, а также на борту Вояджера Вояджер , где регенерировали Семь из Девяти, а затем и дети Боргов. (VOY: «Призраки двенадцатой палубы»; Star Trek: First Contact )

Дрон Борг может работать до 200 часов, прежде чем потребуется его регенерация. Седьмой из Девяти, когда она была отделена от Коллектива, требовалось регенерировать не менее трех часов в день для поддержания своего здоровья.(ВОЙ: «Охотники»)

Дроны-борги также регенерируют за пределами своих ниш, когда нанозонды ремонтируют сам дрон, а их кибернетические компоненты проходят техническое обслуживание и ремонт на микроскопическом уровне, так как они также могут восстанавливать клетки. (ЛОР: «Регенерация»)

Когда Седьмая из Девяти обсуждала с Леуконом регенеративные потребности Ичеб, она объяснила, как она адаптировала нейронный трансивер для взаимодействия с портативным регенератором. Семь подсчитал, что у устройства достаточно энергии, чтобы выполнить один полный цикл для Ичеба; прежде чем добавить, что « [i] t важно, чтобы Ичеб регенерировал в течение шести непрерывных часов. «Можно предположить, что она предоставила такие устройства Азану, Реби и Мезоти, когда они покинули корабль « Вояджер ». (ВОЙ:« Детские игры »,« Несовершенство »)

Дроны-борги также могут регенерировать и восстанавливать повреждения корабля боргов, например куб борга или сферу борга из альковов. (TNG: «Q Who»; VOY: «Dark Frontier»)

Эффект регенерации куба Борга в «Q Who» был создан путем создания масштабной копии «стены» куба Борга, плавления ее паяльной лампой, а затем воспроизведения отснятого материала в обратном порядке во время съемок. ^{(необходима ссылка • редактировать)}

Иногда тревожные мысли могли прервать цикл регенерации Борга. (ВОЙ: «Детские игры»)

Подмены

Одо, теряющий способность сохранять форму

Подменыш мог оставаться в твердой форме только от шестнадцати до восемнадцати часов непрерывно, после чего им нужно было вернуться в студенистое состояние. (DS9: «Рассказчик», «Отрекшиеся», «Альтернатива», «Поиски, часть I»; DS9: «Один человек», «В тени Чистилища»)

Несоблюдение этого правила может привести к повреждению их морфогенного матрикса, что проявляется в обесцвечивании и «отслаивании» массы.(ДС9: «Жребий брошен»)

Джадзия Дакс часто заходил в покои Одо, пока тот регенерировал, и передвигал несколько предметов своей мебели всего на несколько сантиметров, зная, что это будет раздражать констебля. (DS9: «Homefront»)

После того, как Одо (выступающий в качестве судьи) объявил забастовку в бейсбольном матче между Девятками и Логиками, Бенджамин Сиско заявил, что Одо, должно быть, регенерировал и вообще не смотрел игру. (ДС9: «Отведи меня в голокостюм»)

Гидеоны

Гидеоны постоянно регенерировали свои тела, а это означало, что, если не считать несчастных случаев и болезней, они были бессмертными.(TOS: «Знак Гедеона»)

Виды 8472

В 2373 году лейтенант-коммандер Тувок обнаружил, что повреждение стены внутри биокорабля Вид 8472 было вызвано лучом разрушителя Борга. Однако стена, казалось, восстанавливалась. (ВОЙ: «Скорпион»)

См. Также

(PDF) Антибактериальные полимеры на биологической основе для черепно-челюстно-лицевой регенерации

Прил. Sci. 2020,10, 8371 20 из 23

62.

Ezati, M .; Сафавипур, Х.; Houshmand, B .; Фагихи, С. Разработка электропряденого композита PCL / желатин / хитозан /

β

-TCP

для направляемой регенерации кости. Прог. Биоматер. 2018,7, 225–237. [CrossRef]

63.

Chen, J.L .; Чжао Ю. Влияние молекулярной массы, кислоты и пластификатора на физико-химические и антибактериальные свойства

Пленок на основе β-хитозана. J. Food Sci. 2012,77, 127–136. [CrossRef]

64.

Mellegård, H .; Стрэнд, С.; Christensen, B.E .; Granum, P.E .; Харди, С.П. Антибактериальная активность химически определенных

хитозанов: влияние молекулярной массы, степени ацетилирования и тест-организма. Int. J. Food Microbiol.

2011,148, 48–54. [CrossRef] [PubMed]

65.

Kaya, M .; Баран, Т .; Erdo˘gan, S .; Mente¸s, A .; A¸san Özüsa˘glam, M .; Чакмак, Ю.С. Физико-химическое сравнение

хитина и хитозана, полученных от личинок и взрослых колорадских жуков (Leptinotarsa ​​decemlineata).

Матер. Sci. Англ. C 2014,45, 72–81. [CrossRef] [PubMed]

66.

Zhou, T .; Лю, X .; Sui, B .; Liu, C .; Мо, X .; Сан, Дж. Разработка композитных нановолокон рыбий коллаген / биоактивное стекло / хитозан

в качестве мембраны GTR / GBR для стимуляции регенерации тканей пародонта. Биомед. Матер.

2017,12. [CrossRef] [PubMed]

67.

Ma, S .; Adayi, A .; Liu, Z .; Li, M .; Wu, M .; Xiao, L .; Sun, Y .; Cai, Q .; Ян, X .; Чжан, X .; и другие.

Асимметричная коллаген / хитозановая мембрана, содержащая наночастицы хитозана, нагруженные миноциклином, для направляемой регенерации кости

.Sci. Rep. 2016,6, 31822. [CrossRef] [PubMed]

68.

Saarani, N.N .; Джамуна-Тхеви, К .; Shahab, N .; Hermawan, H .; Саидин, С. Антибактериальная эффективность трехслойной

сополимера молочной и гликолевой кислоты / наноапатита / лауриновой кислоты регулирует регенерацию костной мембраны на пародонте

бактерий. Вмятина. Матер. J. 2017, 36, 260–265. [CrossRef]

69.

Mart

í

n-del-Campo, M .; Sampedro, J.G .; Flores-Cedillo, M.L .; Росалес-Ибаньес, Р.; Рохо, Л. Регенерация костей

, индуцированная биогибридными растениями, содержащими стронций-фолат. Molecules 2019,24, 1660. [CrossRef]

70.

Ding, Y .; Li, W .; Correia, A .; Ян, Й .; Zheng, K .; Лю, Д .; Schubert, D.W .; Boccaccini, A.R .; Santos, H.A .;

Roether, J.A. Электропрядение полигидроксибутират / поли (



-капролактон) / золь-гель кремнеземная гибридная скальпель

с функцией высвобождения лекарств для инженерии костной ткани.ACS Appl. Матер. Интерфейсы

2018

,

10, 14540–14548. [CrossRef]

71.

Hamlekhan, A .; Moztarzadeh, F .; Mozafari, M .; Адзами, М .; Незафати, Н. Получение ламинированного поли (

ε

—

капролактон) -гелатин-гидроксиапатитного нанокомпозитного каркаса, созданного с помощью сложных технологий для замены кости

. Biomatter 2011,1, 91–101. [CrossRef]

72.

Thai, T.H .; Нунтанаранонт, Т.; Камолматякуль, С .; Meesane, J.

In vivo

оценка модифицированного шелкового фиброина

чешуи с имитированным микросредой фибронектина / децеллюляризованной ткани пульпы для челюстно-лицевой хирургии

. Биомед. Матер. 2018,13. [CrossRef]

73.

Timin, A.S .; Муслимов, А.Р .; Лепик, К.В .; Сапрыкина, Н.Н .; Сергеев, В.С .; Афанасьев, Б.В .; Вилесов, А.Д .;

Сухоруков, Г.Б. Гибридные неорганические-органические микрокапсулы с тройным откликом в качестве биосовместимой интеллектуальной платформы

для доставки малых молекул.J. Mater. Chem. В 2016,4, 7270–7282. [CrossRef]

74.

Timin, A.S .; Муслимов, А.Р .; Зюзин, М.В .; Peltek, O.O .; Карпов, Т.Е .; Сергеев, И.С .; Доценко, А.И .;

Гончаренко А.А .; Ёлшин, Н.Д .; Синельник, А .; и другие. Многофункциональные чешуйки с улучшенными противомикробными свойствами и остеогенностью

на основе пьезоэлектрических электропряденых волокон, декорированных микрокапсулами из биоактивного композита

. ACS Appl. Матер. Интерфейсы 2018,10, 34849–34868. [CrossRef] [PubMed]

75.

Cornelsen, M .; Probst, F.A .; Schwarz, C .; Burian, E .; Tröltzsch, M .; Отто, S .; Saller, M.M .; Schieker, M .; Зейтц, Х.

Механические и биологические эффекты инфильтрации биополимерами на трикальцийфосфат, напечатанный на 3D-принтере.

скафт. Вмятина. Матер. J. 2017, 36, 553–559. [CrossRef] [PubMed]

76.

Sarasam, A.R .; Brown, P .; Khajotia, S.S .; Dmytryk, J.J .; Мадихаллы, С.В. Антибактериальная активность матриц

на основе хитозана в отношении возбудителей заболеваний полости рта.J. Mater. Sci. Матер. Med. 2008,19, 1083–1090. [CrossRef] [PubMed]

77.

Sarasam, A .; Мадихаллы, С.В. Характеристика смесей хитозан-поликапролактон для тканевой инженерии

приложений. Биоматериалы 2005,26, 5500–5508. [CrossRef]

78.

Thoma, D.S .; Jung, R.E .; Schneider, D .; Cochran, D.L .; Эндер, А .; Jones, A.A .; Görlach, C .; Uebersax, L .;

Graf-Hausner, U .; Hämmerle, C.H.F. Увеличение объема мягких тканей с помощью матриц на основе коллагена:

Объемный анализ.J. Clin. Пародонтол. 2010 г., 37, 659–666. [CrossRef]

79.

Agis, H .; Коллинз, А .; Taut, AD; Jin, Q .; Kruger, L .; Görlach, C .; Джаннобиле, В.В. Кинетика клеточной популяции

коллагеновых отложений при заживлении ран полости рта Ex vivo. PLoS ONE 2014,9, e112680. [CrossRef]

80.

Özmeriç, N .; Özcan, G .; Haytaç, C.M .; Alaaddino

ˇ

glu, E.E .; Саргон, М.Ф .; ¸Senel, S. Пленка хитозана, обогащенная

антиоксидантом, таурином, при дефектах фенестрации.J. Biomed. Матер. Res. 2000,51, 500–503. [CrossRef]

Передача сигналов PI3K – GSK3 регулирует регенерацию аксонов млекопитающих путем индукции экспрессии Smad1

Создание модели

для регенерации аксонов in vitro

Чтобы исследовать компоненты передачи сигналов или пути, участвующие в регенерации аксонов, мы установили in vitro Модель (рис. 1a), которая может воспроизводить in vivo регенерацию аксона , индуцированную периферической аксотомией. Подобно индукции RAG, которая происходит in vivo после периферической аксотомии, мы обнаружили заметную активацию нескольких белков, кодируемых хорошо известными RAG, таких как gap43, c-jun, atf3 , gadd45α и sprr1a , во взрослых нейронах DRG в течение 3 дней культивирования (рис.1б). Когда культивируемые нейроны были реплантированы, нейроны расширили новые аксоны, которые были длинными, но редко разветвленными (Fig. 1c), напоминающими морфологию кондиционирующих поврежденных нейронов ²⁸ . Этот удлиненный способ роста аксонов отличается от роста аксонов, индуцированного фактором роста нервов (NGF), который способствует обширному ветвлению, но относительно умеренному удлинению во взрослых нейронах DRG (Fig. 1c). Эти результаты показывают, что взрослые нейроны DRG приобретают биохимические и морфологические свойства, аналогичные предварительно условно поврежденным нейронам после проведения процедур культивирования и репликации.

Рис. 1: Создание протокола культивирования и повторного планшета для исследования механизмов регенеративного роста аксонов in vitro .

( a ) Схема протокола культивирования и повторного планшета. Нейроны DRG отделяли от взрослых мышей и культивировали в течение 3 дней. Затем были реплицированы нейроны, чтобы заново запустить рост аксонов. Регенеративный рост аксонов оценивали путем измерения длины аксонов реплицированных нейронов через 20 ч после репликации. ( b ) Культура in vitro воспроизводит индуцированную периферической аксотомией активацию нескольких белков, которые кодируются хорошо известными RAG, такими как ATF3, c-Jun, GAP43, GADD45a и SPRR1a.Показаны репрезентативные иммуноблоты из лизатов нейронов DRG, культивированных в течение 3 часов или 3 дней. Антитела к актину использовали в качестве контроля нагрузки. ( c ) Нейроны DRG после репликации вырастают длинные, редко разветвленные аксоны, аналогичные нейронам, которые были кондиционированы in vivo путем перерезки седалищного нерва. Обратите внимание, что режим роста аксонов после репликации отличается от режима роста, индуцированного NGF (50 нг / мл ^-1 ), который стимулирует обширное ветвление, но относительно умеренное удлинение.Шкала 200 мкм. ( d , e ) Взрослые нейроны DRG были диссоциированы, культивированы в течение 3 дней, а затем повторно высеяны для индукции роста аксонов заново, как показано в a . Нейроны обрабатывали DBR (20 мкМ), нокодазолом (50 нМ) или контрольным носителем (ДМСО) либо до (пурпурные столбцы в и ), либо после повторного посева (синие столбцы в и ), как указано. Схемы (верхние левые вставки в d ) изображают, когда нейроны обрабатывали интересующими лекарствами. Цветные столбцы показывают период, когда нейроны подвергались действию наркотиков.Белые, серые и черные стрелки указывают начальную точку начального 3-дневного периода культивирования, время репликации и время фиксации нейронов для анализа, соответственно. Регенеративный рост аксона оценивали путем измерения длины аксона после репликации. Репрезентативные изображения нейронов после репликации показаны в d . Количественное определение длины аксона из трех независимых экспериментов показано в и . Шкала 200 мкм. Планки погрешностей представляют собой s.e.m. *** П <0.001, непарный двусторонний тест Стьюдента t -тест. Исходные изображения иммуноблота показаны на дополнительном рисунке S10.

Мы применили метод культивирования и репликации, чтобы выяснить, требует ли регенеративный рост аксонов транскрипция гена. Для этого был обработан обратимый ингибитор РНК-полимеразы II 5,6-дихлорбензимидазол-рибозид (DBR). Как и ожидалось, добавление DBR в течение начального 3-дневного периода культивирования почти прекращало рост аксонов (дополнительный рис. S1), указывая на необходимость транскрипции гена.Нейроны, обработанные DBR в течение начального 3-дневного периода культивирования, не смогли вырастить аксоны после репликации, даже если DBR был вымыт во время репликации, а затем нейроны культивировали без лекарства (фиг. 1d, e). Эти результаты предполагают, что транскрипция гена в течение начального 3-дневного периода культивирования важна как для начального, так и для регенеративного роста аксонов. Напротив, когда нейроны были впервые культивированы в отсутствие DBR, но DBR был добавлен во время репликации, а затем реплицированные нейроны увеличили аксоны до степени, сравнимой с контрольными нейронами, которые никогда не подвергались воздействию DBR (рис.1г, д). Эти результаты согласуются с предыдущим исследованием, показывающим, что DBR не влиял на рост аксонов в культуре, если нейроны были предварительно кондиционированы in vivo за несколько дней до диссоциации ²⁸ . Следовательно, дискретный период активной транскрипции генов важен для зрелых нейронов для обретения способности к росту, и как только нейроны претерпели этот процесс, удлинение аксонов может происходить без продолжающейся транскрипции.

Наряду с транскрипцией генов сборка микротрубочек в дистальном аксоне является еще одним важным детерминантом регенерации аксона ^10,17,18,30 .Как и ожидалось, ослабление динамики микротрубочек путем обработки нокодазолом в течение начального 3-дневного периода культивирования резко предотвращало рост аксонов (дополнительный рисунок S1). Однако реплантированные нейроны удлиняют длинные аксоны, когда нокодазол вымывается во время репликации (рис. 1d, e), что резко контрастирует с результатами лечения DBR. Когда нейроны впервые культивировали в отсутствие нокодазола, но обрабатывали препаратом во время репликации и после этого реплицированные нейроны не смогли удлинить аксоны (рис.1d, e), снова демонстрируя совершенно противоположные результаты от DBR-обработки.

Таким образом, описанный здесь протокол культивирования и репликации резюмирует биохимические (рис. 1b) и морфологические свойства (рис. 1c) регенерации аксонов, вызванной повреждением нерва, и обеспечивает экспериментально доступную систему для исследования транскрипционно-зависимых и локальных сборочно-зависимые механизмы роста аксонов.

Собственная способность к росту аксонов приобретается с помощью передачи сигналов PI3K

Используя протокол культивирования и репликации, мы искали потенциальные регуляторы регенерации аксонов, применяя селективные ингибиторы против известных сигнальных молекул.Мы обнаружили, что LY294002, ингибитор PI3K, подавлял регенеративный рост аксонов, когда его применяли до, но не после репликации (рис. 2a, b). U0126, ингибитор пути ERK, оказывал незначительное влияние независимо от времени лечения препаратом (рис. 2a, b). Помимо воздействия на длину аксона, LY294002 увеличивал частоту ветвления аксонов без изменения общего количества ветвей (дополнительный рис. S2). LY294002 подавлял рост аксонов в нейронах bax ^{— / —} до степени, аналогичной дикому типу (рис.2c), исключая возможность того, что нарушение роста аксонов происходит как вторичное следствие снижения жизнеспособности клеток. Подтверждая фармакологические данные, рост аксонов ингибируется за счет экспрессии доминантно-отрицательной конструкции PI3K (dnPI3K) (Fig. 2d-f), которая эффективно блокирует передачу сигналов PI3K, о чем свидетельствует подавление фосфорилирования AKT (Fig. 2d). Вместе эти результаты указывают на то, что передача сигналов PI3K является потенциальным регулятором регенерации аксонов.

Рисунок 2: Активация передачи сигналов PI3K важна для увеличения потенциала роста аксонов.

( a , b ) Взрослые нейроны DRG культивировали, как показано на фиг. 1a. Нейроны обрабатывали LY294002 (LY, 10 мкМ), U0126 (20 мкМ) или контрольным носителем (ДМСО) либо до (пурпурные столбцы в b ), либо после повторного посева (синие столбцы в b ), как указано. Регенеративный рост аксона оценивали путем измерения длины аксона после репликации. Репрезентативные изображения реплицированных нейронов показаны в и . Количественное определение длины аксона из трех независимых экспериментов показано в b .Шкала 200 мкм. Планки погрешностей представляют собой s.e.m. *** P <0,001, непарный двусторонний тест Стьюдента t -тест. ( c ) Взрослые нейроны DRG от bax ^{— / —} мышей культивировали, как показано на фиг. 1a. Нейроны обрабатывали LY294002 (LY, 10 мкМ) или контролем носителя (ДМСО) либо до (пурпурный столбец), либо после повторного посева (синий столбец), как указано. Регенеративный рост аксона оценивали путем измерения длины аксона после репликации. Показана количественная оценка длины аксона из трех независимых экспериментов.Планки погрешностей представляют собой s.e.m. *** P <0,001, непарный двусторонний тест Стьюдента t -тест. ( d ) Валидация доминантно-отрицательной конструкции PI3K (dnPI3K). Репрезентативные иммуноблоты из 3-дневных культивированных нейронов DRG, трансфицированных либо dnPI3K, либо контрольным вектором (EGFP). ( e , f ) Диссоциированные взрослые нейроны DRG были трансфицированы in vitro только EGFP (контроль) или dnPI3K (меченый myc). Нейроны культивировали в течение 3 дней с последующим повторным культивированием для возобновления роста аксонов.Нейроны фиксировали через 20 ч после повторного посева и окрашивали на нейрональный тубулин βIII, TuJ1 (красный) или метку myc. Трансфицированные нейроны показаны зеленым цветом (EGFP или myc-положительные нейроны). Репрезентативные изображения реплицированных нейронов показаны в и . Количественное определение длины аксона из трех независимых экспериментов показано в f . Шкала 100 мкм. Планки погрешностей представляют собой s.e.m. ** P <0,01, непарный двусторонний тест Стьюдента t -тест. ( г ) Репрезентативные иммуноблоты фосфорилированных Akt и ERK1 / 2, обнаруженных в DRG от наивных или травмированных мышей, подвергшихся перерезке седалищного нерва.( ч ) Репрезентативные иммуноблоты анализа зависимости от времени фосфорилирования AKT в DRG в ответ на повреждение периферического нерва. Исходные изображения иммуноблота показаны на дополнительном рисунке S10.

Мы наблюдали, что уровень фосфо-AKT, но не уровень фосфо-ERK, увеличивался в ответ на перерезку периферического нерва (рис. 2g). Подробный анализ динамики изменений показал, что фосфорилирование AKT достигает пика через 3 дня с последующим дефосфорилированием до исходного уровня через 7 дней (рис.2h), предполагая активацию передачи сигналов PI3K. Когда мы остро заблокировали передачу сигналов PI3K перед повреждением седалищного нерва путем трансфекции dnPI3K во взрослые DRG посредством электропорации in vivo , регенерация сенсорных аксонов была существенно нарушена (рис. 3b, c, дополнительный рис. S7). Эти результаты демонстрируют, что передача сигналов PI3K необходима именно в зрелой нервной системе для усиления регенерации аксонов.

Рисунок 3: Передача сигналов PI3K необходима для активации прорегенеративных ответов и последующей регенерации аксонов in vivo .

( a ) Схема электропорации in vivo и исследование регенерации аксонов. ( b , c ) L4 / L5 DRG взрослой мыши подвергали электропорации in vivo только с EGFP (контроль) или вместе с доминантно-отрицательным PI3K (dnPI3K) в соотношении 1: 3, за которым следовали раздавливание седалищного нерва, как показано в a . Длину всех идентифицируемых регенерирующих аксонов в целых нервах измеряли от места раздавливания (стрелки) до дистальных концов аксонов.Были измерены длины 120 аксонов от шести контрольных мышей и 124 аксонов от шести мышей, трансфицированных dnPI3K. Количественная оценка длины аксона показана в b , а репрезентативные изображения показаны в c . Масштабная линейка 500 мкм. Планки погрешностей представляют собой s.e.m. *** P <0,00001, непарный двусторонний тест Стьюдента t -тест. ( d ) L4 / L5 DRG у взрослых мышей подвергали электропорации in vivo с EGFP (контроль) или dnPI3K (myc-tagged), сразу после чего следовала перерезка седалищного нерва.Через 7 дней после перерезки седалищного нерва нейроны DRG L4 / L5 культивировали в течение ночи и окрашивали на нейрональный тубулин, TuJ1 (красный) или метку myc. Трансфицированные нейроны показаны зеленым цветом (EGFP или myc-положительные). Схема эксперимента изображена в левом верхнем углу. Показаны репрезентативные изображения (справа) и количественная оценка длины аксона (внизу слева) из трех независимых экспериментов. Шкала 100 мкм. Планки погрешностей представляют собой s.e.m. *** P <0,001, непарный двусторонний тест Стьюдента t -тест.( и ) Взрослых мышей сначала подвергали перерезке седалищного нерва. Через 7 дней после повреждения нерва DRG L4 / L5 подвергали электропорации in vivo с EGFP (контроль) или dnPI3K (меченый myc). Через день после электропорации in vivo нейроны из L4 / L5 DRG культивировали в течение ночи и окрашивали на нейрональный тубулин, TuJ1 (красный) или метку myc. Трансфицированные нейроны показаны зеленым цветом (EGFP или myc-положительные). Схема эксперимента изображена в левом верхнем углу. Показаны репрезентативные изображения (справа) и количественная оценка длины аксона (внизу слева) из трех независимых экспериментов.Шкала 100 мкм. Планки погрешностей представляют собой s.e.m. *** P <0,001, непарный двусторонний тест Стьюдента t -тест.

Чтобы исследовать, когда передача сигналов PI3K играет роль, мы вмешивались в передачу сигналов PI3K до или после начала прорегенеративных ответов и исследовали последствия для роста аксонов. Когда in vivo проводилась электропорация dnPI3K непосредственно перед перерезкой седалищного нерва, а затем нейроны из трансфицированных DRG культивировали через 7 дней (рис.3d), нейроны, трансфицированные dnPI3K, удлиняли более короткие аксоны по сравнению с контрольными нейронами, трансфицированными EGFP до периферической аксотомии (рис. 3d). Напротив, dnPI3K не смог блокировать рост аксонов, когда электропорация in vivo выполнялась через 7 дней после перерезки нерва (фиг. 3e). Вместе эти результаты предоставляют достаточно доказательств того, что путь PI3K должен быть активирован до усиления транскрипционно-зависимой регенеративной программы, чтобы способствовать регенерации аксонов.

GSK3, а не mTOR передает сигналы PI3K

Истощение pten ( фосфатаза и гомолог тензина ), гена, кодирующего фосфатазу, которая напрямую противодействует активности PI3K, может способствовать регенерации аксонов как в CNS ²⁹ , так и в CNS ²⁹ PNS ³¹ .В ЦНС активация mTOR, хорошо известного регулятора трансляции белка ³² , как предполагается, опосредует стимулирующий рост эффект истощения pten ^29,33 . В PNS было исследовано участие mTOR, что дало, казалось бы, противоречивые результаты. Одно исследование показало, что передача сигналов mTOR незаменима для усиления регенерации аксонов, индуцированной ингибированием PTEN ³¹ , тогда как другое исследование показало, что ингибирование mTOR подавляет рост аксонов во взрослых нейронах DRG ³⁴ .Очевидное несоответствие может быть связано с различными условиями культивирования, такими как применение факторов роста. Действительно, в последнем исследовании применялась высокая концентрация NGF, который, как известно, активирует ряд сигнальных путей и, следовательно, может усложнить интерпретацию данных. В нашем состоянии нейроны культивировали без добавления NGF или каких-либо других факторов роста. В этом состоянии рапамицин не подавлял рост аксонов независимо от времени лечения препаратом (рис. 4a, b). Мы подтвердили, что обработка рапамицином полностью предотвращала фосфорилирование S6 (рис.4c, d), нижестоящий эффектор mTOR, и, таким образом, может исключить участие mTOR в регуляции регенеративного роста аксонов от взрослых нейронов DRG. Напротив, применение циклогексимида, общего ингибитора трансляции белка, до или после репликации почти прекращало рост аксонов (рис. 4a, b). Эти результаты предполагают, что передача сигналов PI3K способствует регенерации аксонов независимым от mTOR способом во взрослых сенсорных нейронах.

Рис. 4. Регенеративный рост аксонов взрослых сенсорных нейронов требует mTOR-независимого синтеза белка.

( a , b ) Взрослые нейроны DRG диссоциировали, культивировали в течение 3 дней, а затем повторно переселяли, чтобы инициировать рост аксонов заново, как показано на фиг. 1a. Нейроны обрабатывали рапамицином (20 нМ), циклогексимидом (5 мкг мл ^-1 ) или ДМСО (контроль) либо до (пурпурные столбцы в b ), либо после повторного посева (синие столбцы в b ), как указано. и длину аксона измеряли через 20 ч после репликации. Схема и обозначения (верхние левые вставки в и ) идентичны рис.1г. Репрезентативные изображения реплицированных нейронов показаны в a , а количественная оценка длины аксона из трех независимых экспериментов показана в b . Шкала 200 мкм. Планки погрешностей представляют собой s.e.m. n.s., статистически незначимая разница, непарный двусторонний критерий Стьюдента t . ( c ) Типичные изображения контрольных (верхние панели) и обработанных рапамицином (нижние панели) нейронов взрослых DRG, иммуноокрашенных антителами TuJ1 и фосфо-S6. Обратите внимание, что лечение рапамицином полностью предотвращало фосфорилирование S6, но не влияло на рост аксонов.Шкала 200 мкм. ( d ) Репрезентативные иммуноблоты взрослых нейронов DRG, культивированных в течение 3 дней в присутствии или в отсутствие рапамицина. Антитела к актину использовали в качестве контроля нагрузки. Обратите внимание, что лечение рапамицином полностью предотвращало фосфорилирование S6. Исходное изображение иммуноблота показано на дополнительном рисунке S11.

GSK3 представляют собой альтернативные мишени передачи сигналов PI3K и играют важную роль в росте аксонов ²⁰ . Мы обнаружили заметное увеличение N-концевого фосфорилирования серина GSK3 (фосфо-Ser9-GSK3β; фосфо-Ser21-GSK3a) и сопутствующее снижение GSK3-зависимого фосфорилирования CRMP2 в ответ на перерезку седалищного нерва (рис.5а), что свидетельствует об их инактивации. Повышение фосфорилирования Ser9-GSK3, которое произошло in vivo (фиг. 5a) было повторено in vitro (фиг. 5b), которое было почти устранено LY294002, помещая GSK3 ниже передачи сигналов PI3K. Более того, дефект элонгации аксонов, вызванный ингибированием PI3K, был полностью устранен применением двух разных ингибиторов GSK3, 6-броминдирубин-3′-ацетоксима (BIO) или SB216763 (рис. 5c, d). Примечательно, что ингибиторы GSK3 спасали LY294002-индуцированный дефект удлинения аксонов только при применении перед повторным размещением с последующим вымыванием во время повторного размещения.Напротив, BIO существенно блокирует рост аксонов при лечении после репликации (дополнительный рис. S3), эффект, который согласуется с нашим предыдущим исследованием, предполагающим, что истощение GSK3 предотвращает локальную сборку аксонов в конусе роста ¹⁶ . Эти результаты предполагают, что ингибирование GSK3 в соме и дистальном аксоне вызывает противоположные эффекты.

Рис. 5. Инактивация GSK3 в теле клетки отвечает за увеличение транскрипционно-зависимого потенциала роста аксонов ниже передачи сигнала PI3K.

( a ) Типичные иммуноблоты фосфорилированных GSK3α-Ser21, GSK3β-Ser9 и CRMP2-Thr514, обнаруженные в лизатах L4 / 5 DRG от наивных или травмированных мышей, подвергшихся перерезке седалищного нерва. ( b ) Репрезентативные иммуноблоты фосфорилированного GSK3β-Ser9, обнаруженные в диссоциированных взрослых нейронах DRG, культивированных в течение 3 часов или 3 дней. Для 3-дневных культур нейроны обрабатывали LY294002 (LY, 10 мкМ) или контрольным носителем (ДМСО), как указано. ( c , d ) Взрослые нейроны DRG диссоциировали, культивировали в течение 3 дней, а затем повторно переселяли.Нейроны обрабатывали 6-броминдирубин-3′-ацетоксимом (BIO, 500 нМ), SB216763 (SB, 10 мкМ) и / или LY294002 (LY, 10 мкМ), как указано, в течение начального 3-дневного периода культивирования. Реплицированные нейроны культивировали в отсутствие лекарств. Длина аксона измерялась через 20 ч после репликации. Репрезентативные изображения реплантированных нейронов показаны в c , а количественная оценка длины аксона из трех независимых экспериментов показана в d . Шкала 200 мкм. Планки погрешностей представляют собой s.e.m. ** P <0.01; *** P <0,001, непарный двусторонний тест Стьюдента t -тест. ( e , f ) Взрослые нейроны DRG загружали в сомальную сторону двухкамерных камер, как описано в методах. LY294002 (LY, 10 мкМ) и / или BIO (500 нМ, GSK3i) наносили локально либо на сомальную (пурпурные полосы в f ) или на аксональную сторону (синяя полоса в f ), как указано. Ось y в f отображает количество микроканалов, занятых аксонами, выходящими из каналов и входящими в аксональную сторону (после нормализации по отношению к общему количеству каналов).Показаны репрезентативные изображения ( e ) и количественная оценка ( f ) аксонов, попадающих в аксональный компартмент. Схемы двухкамерных камер (верхний левый угол) изображают, куда добавлялись лекарства. Обработка аксональной и сомальной стороны показана синим и пурпурным цветом соответственно. Шкала 200 мкм. n = 3, столбцы ошибок представляют s.e.m. * P <0,01 по сравнению с контролем; *** P <0,001; n.s. статистически незначимая разница по сравнению с контрольным, непарным двусторонним тестом Стьюдента t -тест.Исходные изображения иммуноблота показаны на дополнительном рисунке S11.

Для дальнейшего изучения различных ролей передачи сигналов PI3K-GSK3 в регуляции механизмов, зависящих от клеточного тела по сравнению с локальной сборкой, мы использовали культуральные платформы с двумя компартментами, которые делают возможным изоляцию в жидкости сомальных и аксональных компартментов ^30,35 . В соответствии с экспериментами по культивированию и репликации (рис. 2a, b), LY294002 блокировал рост аксонов только при воздействии на сомальную, но не на аксональную сторону (рис.5д, е). Местное введение BIO в сомальный компартмент полностью устраняет нарушенный рост аксонов, индуцированный LY294002 (рис. 4e, f), подтверждая мнение о том, что путь PI3K-GSK3 регулирует регенерацию аксонов, контролируя реакции клеточного тела (то есть зависимое от транскрипции увеличение внутренний потенциал роста аксонов), а не регулирование аксональных ответов.

В эксперименте по культивированию и репликации обработка только BIO перед реплантацией вызывала небольшое, но статистически значимое усиление роста аксонов по сравнению с контролем (увеличение примерно на 15%) (дополнительный рис.S3). Соответственно, применение только BIO в сомальном компартменте усиливало рост аксонов (на ~ 28%) (рис. 5e, f), демонстрируя заметный стимулирующий рост эффект. Тем не менее, как в экспериментах по культивированию и репликации, так и в экспериментах с двумя камерами, дефект роста аксонов, вызванный ингибированием PI3K, был полностью устранен инактивацией GSK3 (рис. 5d, f), что позволяет предположить, что GSK3 в теле клетки функционирует специфически ниже по течению от PI3K для контроля роста аксонов, хотя сомальная инактивация GSK3 оказывает некоторый общий эффект увеличения роста.

β-catenin незаменим для регенерации сенсорных аксонов

Затем мы искали нижестоящий эффектор пути PI3K-GSK3, который может быть ответственным за реакцию клеточного тела. С этой целью мы проверили возможное участие β-катенина, хорошо известного субстрата GSK3 и регулятора транскрипции гена. Однако ни повреждение периферических нервов (Рис. 6a), ни блокада передачи сигналов PI3K (Рис. 6b) не изменяли уровень β-catenin. Кроме того, истощение β-катенина не влияло на регенерацию аксонов in vivo (рис.6c – e, дополнительный рис. S8), исключая участие β-catenin в регенерации сенсорных аксонов.

Рис. 6: β-катенин незаменим для сенсорной регенерации аксонов.

( a ) Репрезентативные иммуноблоты лизатов DRG от наивных или травмированных мышей. Чтобы вызвать повреждение, мышей подвергали перерезке седалищного нерва и собирали DRG через 3 дня. Антитела к актину использовали в качестве контроля нагрузки. Представлено количественное определение уровня β-катенина, нормализованного по отношению к актину (справа).( b ) Репрезентативные иммуноблоты нейронов DRG, культивированных в течение 3 часов или 3 дней. Для 3-дневных культур нейроны выращивали в присутствии LY294002 (LY, 10 мкМ) или контроля носителя (ДМСО), как указано. Антитела к актину использовали в качестве контроля нагрузки. Представлено количественное определение уровня β-катенина, нормализованного по отношению к актину (справа). Планки погрешностей представляют собой s.e.m. n.s., статистически незначимая разница, непарный двусторонний критерий Стьюдента t . ( c ) Репрезентативные блоты для проверки эффективности миРНК против β-катенина (si-β-катенина) после электропорации in vivo в DRG.Антитела к актину использовали в качестве контроля нагрузки. ( d , e ) L4 и L5 DRG взрослой мыши подвергали электропорации in vivo либо одним EGFP (контроль), либо вместе с si-β-катенином, с последующим раздавливанием седалищного нерва через 2 дня после электропорации. . Регенерацию аксонов оценивали с помощью анализа в целом через 3 дня после повреждения нерва. In vivo электропорацию и исследование регенерации аксонов проводили, как показано на фиг. 3a. Используя цельные нервные сегменты, измеряли длину всех идентифицируемых регенерирующих аксонов от места раздавливания (стрелки) до дистальных концов аксонов.Для количественной оценки измеряли длину в общей сложности 145 аксонов от шести контрольных мышей и 140 аксонов от шести мышей, трансфицированных si-β-катенином. Показаны количественная оценка ( d ) и репрезентативные изображения регенерации аксонов ( e ). Масштабная линейка 500 мкм. Планки погрешностей представляют собой s.e.m. Исходные изображения иммуноблота показаны на дополнительном рисунке S11.

Smad1 функционирует ниже передачи сигналов PI3K-GSK3

Повреждение периферического нерва может увеличивать фосфорилирование фактора транскрипции Smad1 в ядре нейронов DRG, что указывает на его активацию ²³ .Более того, инъекция морфогенетического белка кости (BMP) in vivo может увеличивать фосфорилирование Smad1, сопровождаемое усиленной регенерацией аксонов ³⁶ , что подразумевает роль Smad1 в регенерации аксонов. Мы наблюдали увеличение как фосфо-, так и общего Smad1 через 3 дня культивирования, которые блокировались LY294002. Мы также наблюдали, что LY294002-индуцированное подавление Smad1 полностью устраняется с помощью BIO (Fig. 7a, b), подтверждая, что Smad1 является нижестоящей мишенью передачи сигналов PI3K-GSK3.Поскольку изменения в фосфо- и общем-Smad1 происходят параллельно, мы думаем, что подъем и падение фосфорилирования происходит как следствие измененной экспрессии Smad1, а не через прямую регуляцию фосфорилирования.

Рисунок 7: Индукция Smad1 ниже пути PI3K-GSK3 важна для увеличения транскрипционно-зависимого потенциала роста аксонов.

( a , b ) Вестерн-блот-анализ нейронов DRG, культивированных в течение 3 часов или 3 дней, для исследования уровней фосфо-Smad1 (p-Smad1), Smad1 или GAP43.Для 3-дневных культур нейроны обрабатывали ДМСО, LY294002 (LY, 10 мкМ) и / или 6-броминдирубин-3′-ацетоксимом (BIO, 500 нМ). Репрезентативные изображения и количественная оценка вестерн-блоттинга показаны в a и b . n = 3, столбцы ошибок представляют s.e.m. * P <0,05; *** P <0,001, непарный двусторонний тест Стьюдента t -тест. ( c , d ) Диссоциированные взрослые нейроны DRG были трансфицированы in vitro с помощью EGFP, Smad1 (помечен флагом) и / или доминантно-отрицательным PI3K (dnPI3K) (помечен myc).Нейроны культивировали в течение 3 дней, а затем переселили на ночное культивирование. Затем нейроны фиксировали и окрашивали на тубулин нейронов, TuJ1, метку flag или метку myc. Репрезентативные изображения реплантированных нейронов показаны в c , а количественная оценка длины аксона из трех независимых экспериментов показана в d . Шкала 100 мкм. Планки погрешностей представляют собой s.e.m. * P <0,05; ** P <0,001, непарный двусторонний тест Стьюдента t -тест. ( e ) Диссоциированные взрослые нейроны DRG трансфицировали только EGFP (контроль) или вместе с siRNA против Smurf1 (siSmurf1) и / или dnPI3K, как указано, и культивировали в течение 3 дней.Затем нейроны реплантировали и культивировали в течение ночи. Показана количественная оценка длины аксона из трех независимых экспериментов. Планки погрешностей представляют собой s.e.m. * P <0,05, непарный двусторонний тест Стьюдента t -тест. Эффективность siSmurf1 была подтверждена на взрослых нейронах DRG (иммуноблоты на верхней панели). ( f ) Взрослые нейроны DRG, культивированные в течение 3 часов или 3 дней, подвергали кОТ-ПЦР для исследования уровня мРНК smad1 или gap43 . Для 3-дневных культур нейроны обрабатывали DMSO, LY294002 (LY, 10 мкМ) и / или BIO (500 нМ), как указано.Значения были нормализованы относительно уровня мРНК образца, обработанного ДМСО. n = 3, столбцы ошибок представляют s.e.m. * P <0,05; *** P <0,001, непарный двусторонний тест Стьюдента t -тест. Исходные изображения иммуноблота показаны на дополнительном рисунке S12.

Примечательно, что уровень GAP43, который часто связан с потенциалом роста или регенерации аксонов, отвечал на манипуляции с активностями PI3K и GSK3 аналогично Smad1 (Fig. 7a, b).Чтобы исследовать значимость измененной экспрессии Smad1 в регуляции роста аксонов, мы исследовали, может ли избыточная экспрессия Smad1 восстанавливать ингибирование роста аксонов, индуцированное dnPI3K. Эктопическая экспрессия Smad1 была недостаточной, чтобы способствовать росту аксонов сама по себе, но обращала на себя dnPI3K-индуцированное ослабление роста аксонов (Fig. 7c, d), подтверждая, что Smad1 функционирует ниже передачи сигналов PI3K-GSK3, чтобы контролировать рост аксонов. Однако следует отметить, что хотя степень спасения была значительной (~ 50%), оставшиеся 50% невосприимчивы к избыточной экспрессии Smad1 ясно указывают на существование дополнительных нижестоящих медиаторов передачи сигналов PI3K.

Чтобы исследовать механизм, с помощью которого передача сигналов PI3K-GSK3 контролирует Smad1, мы исследовали возможное участие Smad-специфической E3-ubiquitin протеинлигазы Smurf1. Предыдущая литература предположила, что фосфорилирование Smad1 с помощью GSK3 маркирует Smad1 для Smurf1-зависимого полиубиквитинирования и последующей протеасомной деградации ^37,38,39 . Однако истощение Smurf1 не имело эффекта (Fig. 7e), за исключением Smurf1-зависимой протеасомной деградации как механизма контроля количества Smad1 и последующего роста аксонов.Вместо этого мы обнаружили, что уровень мРНК Smad1 регулируется с помощью передачи сигналов PI3K-GSK3 (Fig. 7f), подтверждая, что транскрипция гена скорее, чем стабильность белка, как механизм контроля уровня Smad1. Эта транскрипционная регуляция Smad1 отличается от хорошо укоренившейся посттрансляционной регуляции Smad1, механизма, представленного в передаче сигналов BMP. BMP индуцирует фосфорилирование Smad1 и его последующую транслокацию в ядро, где Smad1 контролирует экспрессию гена ⁴⁰ . Как и ожидалось с помощью сегрегированных путей активации, BMP4 не влиял на фосфорилирование AKT, и, аналогично, фосфо- и общий Smad1 не были затронуты BIO (дополнительный рис.S4а, б). В примированных нейронах фосфо-Smad1 легко обнаруживается и локализуется почти исключительно в ядре, на которое не влияет BIO (дополнительный рис. S4c, d). Трансфекция dnPI3K предотвращает накопление в ядрах фосфо-Smad1 (дополнительный рис. S4c, d), но это может быть связано со снижением экспрессии Smad1 (см. Рис. 7). В совокупности эти результаты подтверждают, что передача сигналов PI3K-GSK3 способствует регенерации аксонов за счет контроля Smad1, но посредством механизма, отличного от BMP.

Как и в 3-дневной культуре (см. Рис.7a) периферическая аксотомия увеличивает как фосфо-, так и общий Smad1 в DRG (рис. 8a). Важно отметить, что трансфекция siRNAs против Smad1 во взрослые DRG существенно предотвращала регенерацию сенсорных аксонов in vivo (фиг. 8b, c, дополнительная фиг. S9). In vivo трансфекция фосфомиметической формы Smad1, которая, как полагают, является конститутивно активной ³⁸ , была недостаточной для имитации эффекта прекондиционирования и не способствовала росту аксонов (дополнительный рис. S5).Вместе эти результаты предполагают, что Smad1 необходим, но недостаточен для индукции регенерации сенсорных аксонов.

Рисунок 8: Острое истощение Smad1 in vivo предотвращает сенсорную регенерацию аксонов.

( a ) Репрезентативные иммуноблоты лизатов DRG от наивных или травмированных мышей. Мышам подвергали перерезке седалищного нерва, чтобы вызвать повреждение. DRG собирали через 3 дня после повреждения и подвергали вестерн-блоттингу. Показаны репрезентативные иммуноблоты для фосфо-Smad1 (p-Smad1) и Smad1.Антитела к актину использовали в качестве контроля нагрузки. ( b , c ) L4 и L5 DRG взрослой мыши подвергали электропорации in vivo либо только с EGFP (контроль), либо вместе с миРНК против Smad1 (siSmad1), как указано, с последующим раздавливанием седалищного нерва на 2 дней после электропорации. Регенерацию аксонов оценивали с помощью анализа в целом через 3 дня после повреждения нерва. In vivo электропорацию и исследование регенерации аксонов проводили, как показано на рис.3а. Используя цельные нервные сегменты, измеряли длину всех идентифицируемых регенерирующих аксонов от места раздавливания (отмеченного эпиневральным швом, наконечниками стрелок) до дистальных концов аксонов. Для количественной оценки измеряли длину в общей сложности 92 аксонов от шести контрольных мышей и 121 аксона от шести мышей, трансфицированных siSmad1. Показаны количественная оценка ( b ) и репрезентативные изображения ( c ) регенерирующих аксонов. На вставке показано отключение Smad1 с помощью siSmad1 во взрослых нейронах DRG in vivo .Масштабная линейка 500 мкм. Планки погрешностей представляют собой s.e.m. * P <0,05, непарный двусторонний тест Стьюдента t -тест. Исходные изображения иммуноблота показаны на дополнительном рисунке S12.

Зависимое от аксотомии подавление инозитолфосфатаз

Передача сигналов PI3K регулируется балансом между активностью PI3K и активностями инозитолфосфатаз, которые дефосфорилируют PtdIns (3,4,5) P3. Таким образом, изменения уровней и / или активности PI3K или инозитолфосфатаз будут сдвигать баланс и влиять на интенсивность и продолжительность передачи сигналов PI3K.Интересно, что мы обнаружили, что периферическая аксотомия вызывает существенное подавление активности нескольких инозитолфосфатаз (дополнительный рисунок S6), включая pten , inpp4a , inpp4b и inpp5j , все из которых кодируют отрицательные регуляторы активации AKT 906. , 42,43 . Этот результат предполагает, что подавление инозитолфосфатаз во взрослых сенсорных нейронах в ответ на периферическую аксотомию может действовать выше активации передачи сигналов PI3K.

Panhandle Eye Group, ТОО :: Наши врачи

Антонио В. Арагон, II, доктор медицины

Заболевания и хирургия сетчатки глаза

Антонио В. Арагон II, доктор медицины, специализируется на заболеваниях и хирургии сетчатки у специалистов Юго-Запада по сетчатке. Выпускник Университета Нью-Мексико в Альбукерке в 1991 году, он получил степень доктора медицины в Медицинской школе Университета Джона Хопкинса в Балтиморе, штат Мэриленд, в 1995 году, после чего в течение 1996 года проходил стажировку в Синайской больнице Джона Хопкинса.Затем доктор Арагон закончил резидентуру по общей офтальмологии в Центре медицинских наук Университета Вирджинии в Шарлоттсвилле, штат Вирджиния, где он работал главным резидентом в 1998–1999 годах.

В 1999–2000 годах доктор Арагон прошел стажировку по сетчатке / стекловидному телу в Майами, работая главным резидентом в престижном глазном институте Баскома Палмера. После открытия частной практики витреоретинальной хирургии в Альбукерке, он присоединился к команде Panhandle Eye Group в августе 2005 года.

Доктор.Телефон офиса в Арагоне: 806-351-1870 или 888-404-1870.

Эмбер Доблер-Диксон, доктор медицины

Глаукома — лечение, лазер и хирургия

Эмбер Доблер-Диксон, доктор медицины, специалист по глаукоме в компании Panhandle Eye Group, LLP, специализирующейся на лечении глаукомы, лазерном лечении и хирургии. Она закончила бакалавриат в 1981 году в колледже Густава Адольфа в Санкт-Петербурге, штат Миннесота, а затем получила медицинскую степень в Университете Миннесоты в 1986 году.В 1989 году д-р Доблер-Диксон получила сертификат совета по внутренней медицине, а в 1992 году — сертификат совета по офтальмологии. С 1992 по 1993 год она стажировалась по программе лечения глаукомы у доктора Луи Кантора в Университете Индианы.

Доктор Доблер-Диксон начал частную практику в компании Ophthalmic Partners в Форт-Уэрте, штат Техас. В 1998 году она присоединилась к Panhandle Eye Group.

Доктор Доблер-Диксон специализируется на всех областях глаукомы от первичной диагностики до лечения каплями, селективной лазерной трабкулопластики (СЛТ) и хирургии глаукомы.

Свяжитесь с ее офисом по телефону 806-350-1100 или 866-567-0948.

Роберт Э. Джеральд, доктор медицины

Комплексный

Роберт Э. Джеральд, доктор медицины, F.A.C.S., является всесторонним офтальмологом в Panhandle Eye Group, L.L.P. Выпускник 1971 года Техасского университета A&M, доктор Джеральд получил медицинскую степень в 1974 году в Юго-западной медицинской школе Техасского университета в Далласе. Он закончил ординатуру по внутренним болезням в Университете Южной Каролины в Чарльстоне (1975), а затем ординатуру по офтальмологии в Медицинском центре Университета штата Луизиана в Новом Орлеане (1975-1978).

Доктор Джеральд начал интересоваться медициной в очень молодом возрасте. В седьмом классе он посетил Ярмарку штата Техас в Далласе, где его интерес вызвали научные экспонаты, посвященные анатомии и физиологии глаза. Этот опыт поможет установить курс на любовь и преданность на всю жизнь в лечении болезней и хирургии глаза. Он вернулся в Амарилло и начал частную офтальмологическую практику в 1978 году.

Доктор Джеральд любит бегать, готовиться к марафонам и бегать по сверхтрейловым трассам в горах Нью-Мексико, Колорадо и Монтаны.Он утверждает, что это способ помочь ему расслабиться. Он также любит охотиться со своим сеттером Llewellyn, «Ноксом», которого он обожает, играет в гольф и работает на семейном ранчо.

Доктор Джеральд всегда был очень активен в общественных организациях. Он был членом Ротари Клуба Амарилло с 1979 года. Он также является активным членом Медицинского общества округа Поттер Рэндалл с 1978 года и занимал пост президента в 2010-2011 годах. Он был членом правления баптистских общественных служб и регионального медицинского центра Харрингтона.

Доктор Джеральд счастлив быть женатым на Лорел с 1975 года. У них двое взрослых детей, Эшли и Эван.

Доктор Джеральд сертифицирован Американским советом офтальмологии, членом Американского колледжа хирургов, членом Американского общества катарактальной и рефракционной хирургии, Техасской медицинской ассоциации, Техасской офтальмологической ассоциации, Американской академии офтальмологии. , и Американская медицинская ассоциация.

Связаться с доктором.Офис Джеральда: 806-359-7603 или 800-283-8018.

Джон В. Кляйн, доктор медицины

Комплексная офтальмология, хирургия катаракты и рефракционной хирургии глаза

Джон В. Кляйн, доктор медицины, является одним из ведущих врачей-офтальмологов в Panhandle Eye Group, LLP, специализируясь на хирургии катаракты и рефракционной хирургии глаза. Выпускник Техасского A&M в 1987 году, он получил степень доктора медицины в 1993 году в Центре медицинских наук Техасского технологического университета (TTUHSC) в Лаббоке.Доктор Кляйн также прошел интернатуру (1994 г.) и резидентуру по офтальмологии (1997 г.) в TTUHSC.

По окончании ординатуры доктор Кляйн начал частную практику в 1997 году в Региональном глазном центре в Пампе, штат Техас. Он открыл глазной центр Klein Eye Center в Амарилло в 1998 году, который в 2007 году стал филиалом Panhandle Eye Group, LLP.

Доктор Кляйн начал заниматься офтальмологией, потому что ему нравится делать людей счастливыми. Он утверждает, что, когда вы улучшаете их зрение, они счастливы, и он этим очень гордится.Его любимая часть в работе врача — это общение с пациентами, а из-за его спокойного нрава пациенты его обожают.

Доктор Кляйн наслаждается простыми вещами отчасти благодаря своему сельскому воспитанию. Он любит охотиться, ловить рыбу, летать на своем самолете и университетский футбол.

Он активен в католической церкви Св. Томаса и всегда участвует в «Mission Cataract USA». Он женат на своей жене Джессике. У него пятеро детей; два мальчика и три девочки, что также поддерживает его активность.

Доктор Кляйн сертифицирован Советом медицинских экспертов штата Техас (1993) и Американским советом офтальмологов (1999).

С его офисом можно связаться по телефону (806)353-2323 или 888-393-7488.

К. Алан Маккарти, доктор медицины

Комплексная офтальмология и хирургия катаракты

Алан Маккарти, доктор медицины, предоставляет комплексную офтальмологию и хирургию катаракты для Panhandle Eye Group, LLP. Родившись и вырос здесь, он начал свое обучение в колледже Амарилло и окончил Западно-Техасский университет A&M в 1996 году, а в 2000 году получил медицинскую степень в Школе медицины Техасского технологического университета.

Доктор Маккарти вошел в сферу офтальмологии, потому что он считает, что она уникальна тем, что он может выполнять современные операции на пациентах, чтобы помочь восстановить то, что большинство людей назвали бы их самым ценным чувством; чувство зрения. Испытывать радость на лицах своих пациентов, когда им возвращают дар зрения после лечения от глазных болезней, является для него самым полезным аспектом. Доктору Маккарти очень нравится приходить на работу каждый день и наблюдать за тем, как мы улучшаем жизнь пациентов, восстанавливая их зрение.Доктору Маккарти нравятся непринужденные и открытые отношения, которые он развивает со своими пациентами.

Доктор Маккарти женат на Кортни, тоже уроженке Амарилло. У них трое прекрасных детей, девочка Райли и два мальчика Аарон и Джеймсон. В свободное время доктор Маккарти любит не только спорить с тремя детьми, но и путешествовать, ловить рыбу нахлыстом и заниматься спортом.

Д-р Маккарти является активным членом Христианской церкви Хиллсайд, и ему нравится помогать, участвуя в ежегодных миссионерских поездках в Мексику для проведения операции по удалению катаракты.

Доктор Маккарти проходил стажировку в Медицинском центре Penn State Hershey в Херши, штат Пенсильвания (2000-2001), а затем закончил там офтальмологическую ординатуру в 2004 году. Он вернулся в Амарилло, чтобы присоединиться к Panhandle Eye Group в 2004 году. Доктор Маккарти сертифицирован Советом директоров Американский совет офтальмологии (2006 г.).

Свяжитесь с его офисом по телефону 806-351-1177 или 800-782-6393.

W. John W. Murrell, MD

Хирургия катаракты и окулопластика

Джон У.Мюррелл, доктор медицины, является специалистом по хирургии катаракты и окулопластике в компании Panhandle Eye Group, LLP. Он окончил Университет штата Мэн в 1977 году, затем получил медицинскую степень в Медицинской школе Университета Тафтса в Бостоне в 1981 году. Доктор Мюррелл проходил стажировку в больнице Святого Павла в Далласе в 1981-1982 годах, прежде чем стать офтальмологом в Texas Tech Health. Научный центр в Лаббоке в 1986 году.

После завершения стипендии в области офтальмопластической и реконструктивной хирургии в Техасском университете в Хьюстоне, д-р.Мюррелл вернулся в Texas Panhandle. Он открыл свою частную практику по офтальмологии и окулопластической хирургии в 1987 году.

Доктор Мюррелл родился и вырос в штате Мэн. В свободное время любит играть в гольф. Женат, имеет двух взрослых дочерей.

Доктор Мюррелл сертифицирован Советом медицинских экспертов штата Техас, Американским советом офтальмологии и Американским обществом офтальмопластических и реконструктивных хирургов.

Свяжитесь с его офисом по телефону 806-351-1177 или 800-782-6393.

Дж. Эйвери Раш, доктор медицины

Хирургия катаракты и рефракции глаза

Дж. Эйвери Раш, доктор медицины, занимается офтальмологией в Амарилло в течение последних 25 лет. Он специализируется на катаракте и рефракционной хирургии и за годы своей практики выполнил более 30 000 процедур катаракты / имплантации, а также имеет опыт проведения более 20 000 процедур рефракции / LASIK. Он сертифицирован Американским советом хирургии глаза по специальности катаракта / имплантат и рефракционная хирургия.Кроме того, доктор Раш сертифицирован Американской академией офтальмологии.

Свяжитесь с его офисом по телефону 806-353-0125 или 1-800-225-3937

Райан Б. Раш, доктор медицины

Заболевания и хирургия сетчатки глаза

Райан Б. Раш, доктор медицины, («доктор Райан») — специалист в области офтальмологии, специализирующийся на заболеваниях стекловидного тела и сетчатки. Он получил высшее образование в Техасском университете в 2000 году и получил медицинскую степень в Техасском технологическом университете в 2004 году.Доктор Райан прошел интернатуру по внутренним болезням в клинике Ochsner Clinic Foundation, а затем в 2008 году завершил ординатуру по офтальмологии в Тулейнском университете в Новом Орлеане.

После ординатуры доктор Райан еще три года изучал узкую специализацию по заболеваниям стекловидного тела и сетчатки. Он закончил первый год стажировки в области медицины сетчатки в престижном глазном институте Bascom Palmer в Майами в 2009 году, затем получил стипендию в области хирургии сетчатки в Научном центре здравоохранения Техасского университета в Хьюстоне в 2010 году и в Сиднейской офтальмологической больнице в Сиднее, Австралия, в 2011 году.

Доктор Райан сертифицирован Американским советом офтальмологов (2009 г.) и с 2011 г. является членом организации Southwest Retina Specialists.

Свяжитесь с его офисом по телефону 806-351-1870 или 888-404-1870.

Слоан В. Раш, доктор медицины

Хирургия роговицы, катаракты и рефракционной хирургии

Слоан В. Раш, доктор медицины («доктор Слоун») — самый первый специалист по роговице и рефракционной хирургии, прошедший стажировку в Техасском округе Панхандл. Он окончил медицинскую школу в Центре медицинских наук Техасского университета в Сан-Антонио, штат Техас, затем прошел ординатуру в Центре медицинских наук Техасского технологического университета в Лаббоке, штат Техас, а затем стажировку в Институте глаз Кейси в Портленде, штат Орегон.Доктор Слоун стремится обеспечить высочайший уровень индивидуального ухода за пациентами с состраданием и честностью. Для него большая честь вернуть домой в Amarillo и Panhandle Eye Group свой опыт в области новейших передовых технологий в области роговицы и рефракционной хирургии.

Доктор Слоан принимает активное участие во многих исследовательских проектах. Опубликовав более двух десятков клинических исследований в рецензируемых научных журналах до 35 лет, он продолжает стремиться к разработке инновационных методов, которые помогут улучшить результаты лечения пациентов.Особый интерес вызывает то, что в настоящее время он изучает местную терапию стволовыми клетками для регенерации роговицы и лечения синдрома сухого глаза. Доктор Слоун намерен продолжать применять самые передовые методы лечения, чтобы лучше заботиться о пациентах прямо здесь, в Техасском районе Панхандл.

Доктор Слоан посвятил свою жизнь Иисусу Христу как Господу и Спасителю и считает это самым значительным событием в своей жизни. Помимо первоклассного ухода за глазами, доктор Слоан страстно увлечен офтальмологической практикой и служением Господу.Он оказывал офтальмохирургическую помощь малообеспеченным пациентам по всей Латинской Америке в нескольких христианских организациях. Он был очень благословлен тем, что мог служить и прославлять Бога в этом качестве. Доктор Слоан любит гольф, катание на лыжах, отдых на природе и времяпрепровождение со своей семьей. У него прекрасная жена Дженнифер и трое великолепных детей: Эмми, Тру и Мабри.

Доктор Слоан является сертифицированным научным сотрудником Американского совета офтальмологии.

Свяжитесь с его офисом по телефону 806-353-0125 или 800-225-3937.

YAP опосредует регенерацию волосковых клеток в органах баланса цыплят, но киназы LATS подавляют его активность у мышей

Введение

От потери слуха страдают более 400 миллионов человек во всем мире, а нарушения равновесия поражают еще миллионы (Agrawal et al., 2009; World Health Организация, 2018). Потеря сенсорных волосковых клеток (HCs) во внутреннем ухе является основной и постоянной причиной этих нарушений, поскольку утраченные HCs не восстанавливаются эффективно у людей и других млекопитающих (Forge et al., 1993; Надоль, 1993; Warchol et al., 1993; Голуб и др., 2012; Mizutari et al., 2013). Напротив, птицы, рыбы и земноводные эффективно заменяют УВ после повреждения и восстанавливают сенсорную функцию (Corwin, Cotanche, 1988; Ryals, Rubel, 1988; Jones, Corwin, 1996; Smolders, 1999; Harris et al., 2003; Smith et al., 2003; Smith et al., 2003). al., 2006; Lush, Piotrowski, 2014). У этих немлекопитающих соседние поддерживающие клетки (SC) либо генерируют потомство, которое заменяет HC, либо конвертируются непосредственно в HC (Balak et al., 1990; Adler and Raphael, 1996; Baird et al., 1996). Однако способность SCs млекопитающих делиться и замещать HCs резко снижается после рождения по причинам, которые пока неясны (Burns et al., 2012a; Cox et al., 2014). Усилия по усилению регенеративного ответа SCs млекопитающих включали лечение факторами роста, ингибирование передачи сигналов Notch и стимуляцию канонической передачи сигналов Wnt (Gu et al., 2007; Wang et al., 2015a; You et al., 2018). Эти манипуляции перспективны для новорожденных мышей, но их эффективность снижается по мере взросления млекопитающих и перехода SC в более устойчивое состояние покоя (Gu et al., 2007; Колладо и др., 2011b; Maass et al., 2015; Аткинсон и др., 2018; Самараджива и др., 2018). Остается необходимость понять механизмы, которые поддерживают SCs млекопитающих в этом состоянии покоя.

Возможное объяснение возникло в результате исследований матки, одного из видов органа равновесия. В культивируемых листах утрикулярного эпителия SCs от незрелых мышей быстро распространяются и размножаются, но способность распространяться и размножаться резко снижается с возрастом (Davies et al., 2007; Meyers and Corwin, 2007; Lu and Corwin, 2008).В то же время SCs млекопитающих развивают усиленные апикальные соединения с высокими уровнями E-кадгерина и исключительно толстыми кольцевыми полосами F-актина (Burns et al., 2008, 2013; Collado et al., 2011b; Luo et al., 2018) . Напротив, SCs от кур экспрессируют мало E-cadherin, имеют тонкие полосы F-actin на своих апикальных соединениях и свободно распространяются и размножаются на протяжении всей жизни (Burns et al., 2008, 2013). Выводы привели нас к исследованию пути Hippo и его эффектора, Yes-ассоциированного белка (YAP), которые объединяют механические и биохимические факторы для контроля над пролиферацией (Irvine and Shraiman, 2017; Totaro et al., 2018).

В каноническом пути Hippo киназный каскад MST1 / 2 и LATS1 / 2 фосфорилирует YAP, что приводит к его цитоплазматической секвестрации и деградации (Dong et al., 2007; Zhao et al., 2007, 2010). В отсутствие такой ингибирующей передачи сигналов YAP может накапливаться в ядрах, где он способствует пролиферации с помощью факторов транскрипции TEAD (Vassilev et al., 2001; Zhao et al., 2007). Транскрипционная активность YAP-TEAD снижается в ответ на увеличение плотности клеток во время утрикулярного развития, что способствует начальной остановке роста (Gnedeva et al., 2017), но роль MST1 / 2 и LATS1 / 2 во внутреннем ухе еще не изучена. Мы предположили, что повреждение легко реактивирует передачу сигналов YAP-TEAD в SCs в регенеративных ушах немлекопитающих, но не в ушах млекопитающих.

Здесь мы сообщаем, что в матке курицы MST1 / 2-зависимая передача сигналов Hippo секвестрировала YAP в цитоплазме SC, и что потеря HC заставляла YAP накапливаться в ядрах и способствовать регенеративной пролиферации. В SC мышиного маточного пузыря YAP оставался цитоплазматическим после потери HC.Там пролиферативное молчание было преодолено экспрессией нечувствительных к фосфорилированию вариантов YAP или условной делецией LATS1 / 2, даже в маточках от взрослых мышей. Полученные данные обеспечивают новую механистическую основу для объяснения различий в регенеративной замене HCs между млекопитающими и немлекопитающими и впервые демонстрируют, что передача сигналов YAP-TEAD может использоваться для содействия пролиферации SCs во внутреннем ухе млекопитающих.

Результаты

Потеря HC приводит к ядерному накоплению YAP в куриных SC, но не в клетках мышей

Поскольку клетки регулируют активность YAP частично, контролируя его ядерный доступ (Shreberk-Shaked and Oren, 2019), мы проверили, вызовет ли потеря HC ядерное накопление YAP в SC, которые необходимы для регенерации HC у посленкушенных цыплят.Мочки культивировали с 1 мМ стрептомицином в течение 24 часов для уничтожения HCs и фиксировали через 2 дополнительных дня в среде, свободной от стрептомицина. Затем для конфокальных изображений ядерного слоя SC вычисляли отношения N: C иммуноокрашивания YAP. Обработка стрептомицином снижала плотность УВ до 11% от уровня в необработанных контрольных культурах ( p <0,0001, t ₍₁₀₎ = 16,77, n = 6 пузырьков на состояние; Рис.1 A , C , I ), что привело к увеличению отношения N: C YAP на 22% ( p <0.0001, t ₍₁₀₎ = 8,248, n = 6 бутылок на состояние; Рис.1 B , D , J ).

Мы использовали тот же протокол, чтобы определить, будет ли потеря HC индуцировать ядерную транслокацию YAP в SC матрикса мышей постнатального дня 1 (P1). Здесь обработка стрептомицином снизила плотность HC до 55% от уровня в неповрежденных контрольных культурах ( p = 0,0004, t ₍₁₄₎ = 4,583, n = 8 пузырьков на условие; Рис.1 E , G , I ), но мы не наблюдали разницы в соотношении N: C YAP (0,89 ± 0,10 против 0,89 ± 0,11, p = 0,9818, t ₍₁₄₎ = 0,02327, n = 8 бутылок; рис.1 F , H , J ).

Чтобы проверить, опосредуют ли YAP и TEAD регенеративную пролиферацию в куриных маточках, мы культивировали матки со стрептомицином или без него в течение 24 часов для уничтожения HCs. Затем маточки культивировали еще 2 дня в различных концентрациях CA3, низкомолекулярного ингибитора транскрипционной активности YAP-TEAD (Song et al., 2018). EdU добавляли за 24 ч до фиксации, чтобы пометить клетки, которые вошли в S-фазу. Маточники, обработанные стрептомицином, содержали в 15 раз больше клеток EdU ⁺ , чем неповрежденные контроли ( p <0,0001, t ₍₂₀₎ = 5,48, n = 6-16 мешочков; фиг. 1 M ), а обработка CA3 вызвала дозозависимое снижение этой регенеративной пролиферации ( p = 0,0010, F _(3,34) = 2,528, n = 7-16 пузырьков, ANOVA; рис.1 М ). Другие обработанные стрептомицином матки, которые культивировали с CA3 в течение 6 дней, содержали меньше клеток EdU ⁺ , которые экспрессировали HC-маркер Myo7a, чем соответствующие контроли ( p = 0,0337, t ₍₆₎ = 2,741, n = 4 шт .; рис. 1 К – М ). Напротив, абляция HC не способна вызвать значительную регенеративную пролиферацию в матках мышей P1 в течение 3-дневного периода восстановления ( p = 0,73, t ₍₁₆₎ = 0.35, n = 9 бутылочек; Рис.1 N ). В совокупности результаты предполагают, что потеря HC в маточках кур модулирует передачу сигналов, которая ведет к накоплению YAP в ядрах и регенеративной пролиферации SCs, но менее серьезная потеря HC в маточках мышей этого не делает.

Рисунок 1.

YAP накапливается в ядрах SC после потери HC и опосредует регенеративную пролиферацию в маточках кур, но не мышей. A-H , Мочеиспускания от кур P2 и мышей P1 культивировали в течение 24 часов со стрептомицином или без него и фиксировали через 72 часа для оценки потери HC на конфокальных изображениях апикальной поверхности и соотношений YAP N: C в SC ядерном слое.Стрептомицин индуцировал потерю HC у обоих видов, но YAP накапливался в ядрах SC только в поврежденных куриных маточках ( D ). Изображалась центральная (предполагаемая стриолярная) область маточного пузыря мыши ( E – H ). I , Количественная оценка показывает значительную потерю HC в обработанных стрептомицином маточках цыплят ( p <0,0001, n = 6 матриц) и мышей (всего: p = 0,0004, n = 8). Региональные сравнения мышиного пузыря проводились с помощью теста Сидака (широта: p = 0.48; Cen: p = 0,0065, Med: p <0,0001, n = 6-8). J , Количественная оценка соотношений YAP N: C выявляет значительное увеличение количества куриных маток, обработанных стрептомицином ( p <0,0001, n = 6). Повреждение не повлияло на матриксы мыши (всего: p = 0,98, n = 8). Региональные сравнения мышиного пузыря были выполнены с помощью теста Сидака (Lat: p = 0,99; Cen: p = 0,87, Med: p = 0.996, n = 8). K , L , Конфокальное изображение обработанных стрептомицином куриных маток P2. Те, которые культивировались с ДМСО ( K ), содержали значительно больше клеток EdU ⁺ и Myo7a ⁺ EdU ⁺ клеток (стрелка), чем те, которые культивировались с 1 мкМ CA3 ( L ) в течение 7 дней. M , Количественная оценка клеток EdU ⁺ через 3 дня (пурпурные столбцы, левая ось y ) и Myo7a ⁺ EdU ⁺ клеток через 7 дней (зеленые столбцы, правая ось и ) в пределах П2 куриные мешочки.Мочалки, обработанные стрептомицином, содержали значительно больше клеток EdU ⁺ , чем неповрежденные матки ( p <0,0001, t тест). Мочалки, обработанные стрептомицином, культивированные с ингибитором YAP-TEAD CA3, содержали меньше клеток EdU ⁺ дозозависимым образом ( p = 0,001, ANOVA с тестом множественных сравнений Даннета, n = 6–16). Обработка CA3 значительно снижала митотическую продукцию HC ( p = 0,034, n = 4). N , Мышиные пузыри P1 культивировали с 1 мМ стрептомицином или без него в течение 24 часов, а затем инкубировали 72 часа в присутствии EdU. Повреждение существенно не повлияло на плотность клеток Sox2 ⁺ EdU ⁺ ( p = 0,73, n = 9). Данные являются средними ± стандартное отклонение. нс p > 0,05, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001.

Механические раны вызывают ядерное накопление YAP более эффективно в SCs цыплят, чем в таковых у мышей

Поскольку стрептомицин убивал меньше HCs в маточках мыши, чем в маточках цыпленка, мы не могли напрямую сравнивать ядерное накопление YAP в их SC после повреждения. .Чтобы обойти эту проблему и проверить, активизирует ли повреждение YAP в куриных SC больше, чем в мышиных SC, мы проанализировали их ответы на стандартизированное иссечение поражения. Через 24 часа культивирования маточки от постнатальных цыплят и мышей P1 поражали микропуншем диаметром 180 мкм и удаляли эпителий в области поражения (Meyers and Corwin, 2007; Collado et al., 2011a). После дополнительных 48 часов культивирования с EdU СК в месте поражения изменили форму и пролиферировали (рис.2 A , C , E , G ). Иммунореактивность YAP была увеличена в ядрах куриных SC на участке поражения (фиг. 2 B , D ). Транслокация была менее выраженной в маточках мышей, при этом YAP равномерно распределялся между ядерным и цитоплазматическим компартментами SC в месте поражения (фиг. 2 F , H ).

Изменение формы клетки (т. Е. Деформация) запускает ядерную транслокацию YAP в других типах клеток (Codelia et al., 2014; Benham-Pyle et al., 2015; Fletcher et al., 2018). Чтобы более тщательно изучить взаимосвязь между изменением формы и накоплением YAP в ядрах в SCs, мы измерили площадь апикального домена и соотношение N: C YAP для отдельных SC в центре каждого участка поражения. Регрессионный анализ показал, что в СК цыплят соотношение N: C YAP положительно коррелировало с площадью апикального домена ( r = 0,531, n = 120 клеток, p <0,0001; рис.2 I ).Обнаружилась значимая, но более слабая положительная корреляция между соотношением YAPN: C и площадью апикального домена SCs мыши в пределах участка поражения ( r = 0,255, n = 120 клеток, p = 0,005; рис. Дж ). Куриные SC имели значительно более высокие отношения N: C YAP, чем мышиные SC, даже при контроле площади клеток ( p <0,0001, F _(1,232) = 147, n = 240 клеток, двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA ; Рис.2 К ). Вне очага поражения достоверных различий в апикальной области не было ( p = 0.69, t ₍₆₎ = 0,42, n = 4 шт .; Рис.2 L ) или соотношение N: C YAP ( p = 0,89, t ₍₈₎ = 0,15, n = 4-6 бутылок; Рис.2 M ) между цыпленком и мышиные СК. Результаты показывают, что ядерное накопление YAP в ответ на повреждение и, в частности, изменение формы ограничено в SCs мыши по сравнению с таковыми у кур.

Рисунок 2.

В SCs, которые изменили форму до близких иссеченных повреждений, ядерное накопление YAP было более выраженным у кур, чем у мышей.После 24 часов культивирования стандартизированные иссеченные очаги поражения были сделаны в маточках от цыплят P2 и мышей P1, которых культивировали еще 48 часов перед фиксацией. A-D , Повреждение вызывало очаговую пролиферативную реакцию в куриной матке ( A , C ). YAP заметно накапливается в ядрах SC, которые расширяются, чтобы закрыть поражение ( D ), по сравнению с плотно упакованными SC вне пораженной области ( B ). E-H , Повреждение также вызывало очаговую пролиферативную реакцию в матке мыши ( E , G ). Умеренное накопление YAP в ядрах было очевидно в СК, которые расширились, чтобы закрыть поражение в центре макулы ( H ) по сравнению с таковыми за пределами области поражения на периферии макулы ( F ). I , Регрессионный анализ выявил значительную связь между отношением N: C YAP и размером апикального домена SC в пораженной области куриной матки (наклон ненулевой при p <0.0001, n = 120 ячеек из 4 ячеек). Пунктирными линиями обозначен 95% доверительный интервал. J , Регрессионный анализ показывает умеренную связь между отношением N: C YAP и размером апикального домена SC в пораженной области матки мыши (наклон ненулевой при p = 0,0050, n = 120 клеток из 4 упаковки). K , Количественная оценка отношения YAP N: C в SC внутри пораженной области показала, что YAP был значительно обогащен ядрами SC матки курицы по сравнению с ядрами матки мыши, контролируя площадь апикального домена (каждый п <0.0001, двусторонний дисперсионный анализ с тестом Сидака, n = 19-58 клеток на ячейку на вид). L , Количественная оценка размера апикального домена SC за пределами пораженной области не выявила существенной разницы между матрицей курицы и мыши ( p = 0,6870, n = 4 матрикса). M , Количественная оценка отношения N: C YAP по конфокальным изображениям ядерного слоя SC в неповрежденной области не выявила существенных различий между куриными и мышиными матками ( p = 0.8852, n = 4–6 бутылок). Все графики отображают среднее значение ± стандартное отклонение. **** п <0,0001.

Острое ингибирование активности киназы MST1 / 2 изменяет локализацию YAP в СК цыплят, но не у мышей

В каноническом пути Hippo каскад киназ MST1 / 2 и LATS1 / 2 фосфорилирует YAP, что приводит к его цитоплазматической секвестрации (Dong и др., 2007). Мы использовали XMU-MP-1, низкомолекулярный ингибитор активности киназы MST1 / 2 (Fan et al., 2016), чтобы проверить, регулирует ли этот канонический путь ядерный доступ YAP в маточках после вылупления цыплят и мышей P1.После 24-часового периода акклиматизации в стандартной среде мы обрабатывали культуры в течение 12 часов XMU-MP-1, носителем или блокатором ядерного экспорта лептомицином B в качестве положительного контроля (Dupont et al., 2011). Лептомицин B значительно увеличивает соотношение N: C YAP у обоих видов, указывая на то, что YAP динамически перемещается в ядра SC и из них в неповрежденных маточках цыплят и мышей (курица: p <0,0001, F _{(5, 20)} = 37, n = 4 или 5, ANOVA; мышь: p <0.0001, F _(2,14) = 56, ANOVA, n = 5 или 6; Рис. 3 A – K ). В куриных маточках ингибирование MST1 / 2 привело к значительному увеличению отношения N: C YAP по сравнению с отрицательными контролями (1,14 ± 0,10 против 0,83 ± 0,07, p <0,0001, ANOVA с тестом Сидака; Рис. 3 A , B ), который был обратимым после 24-часовой отмывки ( p <0,0001, ANOVA с тестом Сидака; фиг.3 E , J ). Мы не наблюдали увеличения отношения YAP N: C в маточках мышей после 12 ч инкубации с ингибитором MST1 / 2 (0.90 ± 0,11 против 0,90 ± 0,04, p = 0,9997, n = 6 кубиков, ANOVA с тестом Даннета; 3 G , H ), хотя 72-часовая инкубация значительно увеличила отношения N: C YAP у обоих видов по сравнению с обработанными ДМСО контролями (курица: 1,04 ± 0,13 против 0,84 ± 0,03, p = 0,0008, t ₍₁₄₎ = 4,23, n = 8 матриц; мышь: 1,09 ± 0,17 против 0,88 ± 0,07, p = 0,0103, t ₍₁₁₎ = 3.09, n = 6 или 7 бутылочек; Рис. 3 L – P ). Результаты подтверждают, что каноническая передача сигналов Hippo необходима для цитоплазматической секвестрации YAP в SCs кур. Эта ингибирующая передача сигналов была легко инактивирована или обойдена при повреждении, что привело к накоплению в ядре YAP (рис. 1). В мышиных SC, однако, цитоплазматическая секвестрация YAP была менее чувствительна к повреждению или острому ингибированию MST1 / 2.

Рисунок 3.

Острое ингибирование активности киназы MST1 / 2 индуцировало ядерное накопление YAP в SCs курицы, но не у мышей. AI , Изображения с большим увеличением иммунореактивности YAP (псевдоцветные) в SC ядерном слое эксплантированных куриных маток P2 ( AF ) или маток мышей P1 ( GI ), культивированных в среде отрицательного контроля, Ингибитор киназы MST1 / 2 XMU-MP-1 (XMU) в концентрации 3 мкМ или лептомицин B (LMB) в концентрации 40 нг / мл в качестве положительного контроля. Через 12 ч интенсивность YAP выше в цитоплазме, чем в ядрах в контроле носителя ( A , G ), и он обогащен ядрами в матрицах, обработанных LMB ( C , I ).Обработка XMU увеличивает ядерные уровни YAP до промежуточной степени в куриной матке ( B ) и является обратимой после 24-часового вымывания ( E ). XMU не влиял на соотношение YAP N: C в матке мыши в течение 12-часового импульса ( H ). Была отображена центральная (стриолярная) область матки мышей ( G – I ). J , Количественная оценка показывает, что 12-часовой импульс XMU значительно увеличивает соотношение N: C YAP по сравнению с контрольными носителями в куриных маточках ( p <0.0001, n = 5 контейнеров, ANOVA с тестом Сидака). Вымывание XMU возвращает отношение N: C YAP к исходным уровням ( p <0,0001, n = 4 или 5). LMB значительно увеличивает соотношение N: C YAP ( p <0,0001, n = 4 или 5). K , Количественная оценка показывает, что 12-часовая обработка LMB значительно увеличивала соотношение YAP N: C в маточках мышей по сравнению с носителем (ANOVA с тестом Даннета, p <0,0001, n = 5 или 6), но XMU не имел никакого эффекта (ANOVA с тестом Даннета, p = 0.99, n = 6). Для сравнений по регионам использовали дисперсионный анализ ANOVA с повторными измерениями с тестом Даннета. L – O , Конфокальные изображения иммунореактивности YAP из ядерного слоя SC в маточках кур P2 ( L , M ) и мышей P1 ( N , O ), которые культивировали в 3 мкМ XMU или ДМСО в течение 72 часов. P , Количественная оценка показывает, что 72-часовая обработка XMU значительно увеличила соотношение YAP N: C в куриных маточках ( p = 0.0008, n = 8) и мышей ( p = 0,0103, n = 6 или 7) по сравнению с обработанными ДМСО контролями. Данные являются средними ± стандартное отклонение. нс p > 0,05, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001.

YAP-S127A индуцирует транскрипционную активность YAP-TEAD и пролиферацию SC в матках новорожденных мышей

Наши данные к этому моменту предполагают, что YAP ограничен цитоплазмой SCs мыши, несмотря на потерю HC и резкое ингибирование MST1 / 2.Мы предположили, что сверхэкспрессия YAP-S127A, который содержит активирующую мутацию серина 127, которая предотвращает связывание с белками 14-3-3 и удерживание в цитоплазме (Basu et al., 2003), может обходить эту регуляцию. Для этого мы скрестили мышей с индуцибельным аллелем Yap-S127A с мышами Sox10 ^{rtTA / +} для получения потомства, в котором трансген будет экспрессироваться в SC и других клетках Sox10 ⁺ только после введения доксициклин (Ludwig et al., 2004; Камарго и др., 2007; Уолтерс и Цзо, 2015). Мы ввели доксициклин внутрибрюшинно потомству P1 и дополнили питьевую воду матери. EdU вводили подкожно на P2, P3 и P4, и собирали маточные частицы на P5. В SC Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / +} мышей иммунореактивность YAP была заметно увеличена по сравнению с SC в матрицах от WT, Sox10 15 / + 906 , и Яп-С127А ^+/- однопометников (рис.4 A – D ). Более того, в маточках с детенышами Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / +} было обнаружено 35-кратное увеличение количества клеток EdU ⁺ по сравнению с контрольными однопометниками (97 ± 54 EdU ⁺ клеток / 10 000 мкм ² , p <0,0001, F _(3,27) = 20,8, n = 5-11 мышей, ANOVA; фиг. 4 A – E ). Эти клетки EdU ⁺ экспрессировали SC-маркер Sox2 (фиг. 4D »).SC EdU ⁺ были расположены по всей матке, но были немного обогащены в латеральной области ( p = 0,0011, F _(2,9,43,1) = 6,5, n = 16 пузырьков, дисперсионный анализ ANOVA с повторными измерениями с Тест Тьюки; рис.4 F ). Ранее было показано, что клетки по латеральному краю матки являются последними, которые выходят из клеточного цикла у постнатальных мышей (Burns et al., 2012b).

Чтобы определить, будет ли YAP-S127A индуцировать транскрипционную активность YAP-TEAD, мы вводили доксициклин, как описано выше, и собирали матриксы на P3 для qRT-PCR.По сравнению с контрольными однопометными животными гены-мишени YAP-TEAD Ctgf , Cyr61 и Ankrd1 были активированы в матках от Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{/ rtTA} мышей в 32, 7 и 181 раз соответственно ( p = 0,0286, тест Манна-Уитни; фиг.4 G ). Экспрессия Myc не изменилась ( p = 0,4571, тест Манна-Уитни), а регулятор клеточного цикла Ccnd1 был активирован в 3 раза ( p = 0.0286, тест Манна-Уитни; Рис.4 H ).

Затем мы попытались определить, смогут ли пролиферирующие SCs в Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / +} мышей дифференцироваться как HC. Поскольку Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / +} щенки, которым вводили доксициклин на P1, не всегда переносили лечение, выходящее за рамки P5, мы изменили наш протокол, чтобы обойти эту токсичность и назначили уменьшенное доза доксициклина (10 мг / кг) для Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / +} мышей и контрольных мышей из однопометников на Р3.EdU поставляли на P4, P5 и P6, а маточные материалы собирали на P24. Мыши Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / +} мышей содержали 7 ± 4 Myo7a ⁺ , EdU ⁺ клеток / 10000 мкм ² , контрольные потомки ( p = 0,0006, t ₍₉₎ = 5,2, n = 3–8 мышей; рис. 4 I – L ). Контралатеральные матки, которые были иммуноокрашены на Myo6, содержали в 40 раз больше клеток Myo6 ⁺ , EdU ⁺ , чем контроли из одного помета ( p <0.0001, t ₍₈₎ = 7,4, n = 3-7 мышей; Рис.4 K ). Таким образом, реактивация передачи сигналов YAP-TEAD в SC матрикса новорожденных мышей стимулирует их к образованию потомства, которое экспрессирует HC-маркеры in vivo .

Транскрипционная активность YAP-TEAD также может вызывать отрицательную обратную связь (Dai et al., 2015; Moroishi et al., 2015; Park et al., 2016). Сообщается, что E-кадгерин является негативным регулятором YAP в других эпителиях (Kim et al., 2011; Benham-Pyle et al., 2015), и предполагается, что он ограничивает активность YAP в SC матрикса млекопитающих (Kozlowski et al., 2020). Чтобы проверить, влияет ли экспрессия YAP-S127A на экспрессию E-кадгерина, мы вводили доксициклин Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / +} мышам и контрольным мышам из помета в точке P1. На P5 интенсивность иммуноокрашивания E-кадгерином на стыках SC-SC утроилась в мешочках Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / +} по сравнению с контрольными однопометниками ( p = 0.0002, t ₍₂₂₎ = 4,4, n = 12 мышей; Рис. 5 A – C ). В мешочках, собранных на P3 для qRT-PCR, уровни транскриптов E-кадгерина были вдвое выше, чем в контроле ( p = 0,0286, тест Манна-Уитни, n = 4; фиг. 5 D ).

Было высказано предположение, что высокая плотность клеток инактивирует передачу сигналов YAP-TEAD в развивающейся матке мышей (Gnedeva et al., 2017). Чтобы определить, преодолевает ли индукция YAP-S127A на P1 эту регуляцию, мы вводили доксициклин Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / +} мышам и контрольным мышам из помета на P1.Затем мы собрали матки в точке P5 и провели иммуноокрашивание на HC-маркер Myo7a, а также на ZO-1, чтобы очертить апикальные соединения. Площадь желтого пятна не претерпела значительных изменений в результате индукции YAP-S127A (контроль: 0,15 ± 0,02 мм ² по сравнению с YAP-S127A: 0,11 ± 0,05 мм ² , p = 0,208, t _{(7 )} = 1,4, n = 4 или 5 мышей; рис.5 E ), но пространственная плотность SC увеличилась в 1,4 раза ( p = 0,008, t ₍₁₀₎ = 3.3, n = 5–7 мышей; Рис. 5 F – H ). Общая плотность клеток увеличилась в 1,25 раза ( p = 0,033, t ₍₁₀₎ = 2,5), а плотность УВ осталась неизменной ( p = 0,36, t ₍₁₀₎ = 0,96). Результаты показывают, что мутация серина 127 в нефосфорилируемый остаток обходила зависимое от плотности ингибирование, усиливая транскрипционную активность YAP-TEAD и заставляя SCs в матке новорожденных мышей пролиферировать.

Рисунок 4.

Сверхэкспрессия YAP-S127A in vivo в матке новорожденных мышей приводила к широко распространенному вступлению в S-фазу, усилению регуляции генов-мишеней YAP-TEAD и образованию потомства, экспрессирующего маркеры HC. A-D , Доксициклин вводили на P1 и добавляли в питьевую воду плотины. EdU поставляли на P2, P3 и P4, а мешочки собирали на P5. AD , изображения с малым увеличением показывают, что иммунореактивность YAP была более интенсивной у мышей Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / +} ( D по сравнению с мышами из помета D ) контроли ( AC ), что указывает на индукцию экспрессии YAP-S127A.Пунктирными линиями обозначена граница желтого пятна, очевидная для YAP-отрицательных HC сомов. Клетки EdU ⁺ были многочисленны в макулах Yap-S127A ^{+ / —} ; Sox10 ^{rtTA / +} мышей ( D ‘ 915 24), но были редки в других генотипах. A’-C ‘ ). Конфокальные изображения с большим увеличением ядерного слоя SC в латеральной экстрастриолярной области матки демонстрируют иммунореактивность в отношении YAP ( A ′ ′ — D ′ ′ ) и SC-маркера Sox2 с EdU ( A ′ ′ ′ — D ′ ′ ′ ). E , Количественная оценка клеток EdU ⁺ выявила язвы Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / +} мышей имели значительно больший вход в S-фазу (диапазон 13–182 EdU ⁺ клеток / 10000 мкм ² ), чем контроли из однопометного потомства ( p <0,0001, ANOVA, n = 5-11 мышей на генотип). F , Количественная оценка входа в S-фазу по утрикулярной области (ANOVA с тестом Тьюки, n = 16 утрикулов). G , H , Детенышам вводили доксициклин на P1, и собирали матки на P3 для qRT-PCR. Мишки от WT, Yap-S127A ^+/- и Sox10 ^{rtTA / +} детенышей объединяли в качестве отрицательного контроля. Экспрессия генов-мишеней YAP-TEAD Ctgf , Cyr61 и Ankrd1 ( G ) была значительно повышена в Yap-S127A ^+/- ; So10x10 914 / rt 906 мышей по сравнению с отрицательным контролем (каждая p = 0.0286, тест Манна-Уитни, n = 4 биологических повтора). Экспрессия Ccnd1 , но не Myc , значительно увеличивалась в контексте сверхэкспрессии YAP-S127A ( H ) ( p = 0,0286, тест Манна-Уитни, n = 4 биологических повтора). I-L , Доксициклин вводили Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / +} мышей и контрольных однопометников на P3, а EdU подавали на P4, P5.Мочеиспускания собирали на P24. Мочеиспускатели Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / +} мышей содержали большое количество клеток Myo7a ⁺ EdU ⁺ ( J , 21). Клетки Myo6 ⁺ EdU ⁺ ( K , K ‘ ), которые редко встречались в контроле ( I , I’ ). L . Количественная оценка показала, что клетки Myo7a ⁺ EdU ⁺ и клетки Myo6 ⁺ EdU ⁺ были значительно более многочисленными при сверхэкспрессии YAP-S127A в точке P3 (Myo7a: p = 0.0006, n = 3-8 мышей; Myo6: p <0,0001, n = 3–7 мышей). Мишки от WT, Yap-S127A ^+/- и Sox10 ^{rtTA / +} детенышей объединяли для использования в качестве отрицательного контроля. Данные являются средними ± стандартное отклонение. нс p > 0,05, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001.

Рисунок 5. Сверхэкспрессия

YAP-S127A на P1 приводила к усилению регуляции E-кадгерина в SC и приводила к увеличению плотности клеток.Доксициклин вводили мышам Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / +} мышам и отрицательным контролям однопометников в точке P1, и матриксы собирали либо на P5 для иммуногистохимии, либо на P3 для qRT. A , B , Интенсивность иммуномечения E-кадгерина в матрицах Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / + 914 мыши ) был больше, чем в генотипах отрицательного контроля ( A ). C , Количественная оценка интенсивности окрашивания E-кадгерином в соединениях SC-SC, нормализованных к уровням E-кадгерина в несенсорном эпителии, в качестве внутреннего контроля ( p = 0,022, t test, n = 12 матриц) ). D , Количественная оценка экспрессии мРНК Cdh2 по сравнению с Gapdh показывает, что экспрессия удваивается у Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA611916 мышей / мышей отрицательного контроля по сравнению с 90 мышей / контрольных мышей ( стр. = 0.0238, тест Манна-Уитни, n = 4 биологических повтора). E , Количественная оценка макулярной области, как определено маркировкой Myo7a + , не выявляет существенных различий между матками из Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + мыши p = 0,21, n = 4 или 5 мышей). F , Количественная оценка показывает, что общая плотность клеток ( p = 0.033) и плотность SC ( p = 0,008) были значительно увеличены в маточках от Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + мышей по сравнению с контрольными однопометниками ( t test , n = 5-7 мышей). Плотность HC существенно не различалась между клетками Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + мышей и контрольной группы ( p = 0,36, t test, n = 5. -7 мышей). G , H , Иммуноокрашивание маркера апикального соединения ZO-1 и маркера HC Myo7a в латеральной экстрастриолярной области матки. Клетки из Yap-S127A +/- ; Sox10 rtTA / + матрикса мыши ( H ) более плотно упакованы и имеют неправильную форму апикальных доменов по сравнению с контрольными однопометниками 915 (). G ). Данные являются средними ± стандартное отклонение. * p <0.05, *** п <0,001.}

Пролиферативный ответ на YAP-S127A снижается во время постнатального созревания

Экспрессия YAP-S127A стимулировала TEAD-зависимую транскрипцию и пролиферацию SC в матках новорожденных мышей, но было неясно, будут ли SC оставаться отзывчивыми, когда они созреют и войдут в более устойчивую форму. состояние покоя. Чтобы проверить это, мы вводили доксициклин внутрибрюшинно одной группе мышей Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / +} на P3, другой группе на P5 и третьей группе на P9.EdU вводили подкожно один раз в день в течение следующих 3 дней, а через 4 дня после доксициклина собирали матки. После индукции на P3 матриксы мышей Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / +} содержали в 95 раз больше клеток EdU ⁺ , чем контрольные однопометники. Частота вступления в S-фазу упала до менее чем половины этого уровня после индукции на P5 и снизилась до 5% от уровня P3 при индуцировании на P9 ( p <0.0001, F _(2,56) = 61, двусторонний дисперсионный анализ, n = 5-16 мышей; Рис. 6 A – G ).

Одной из возможных мешающих переменных в этом эксперименте in vivo было то, что биологическая доступность доксициклина в ухе, как сообщается, снижается во время постнатального созревания (Walters and Zuo, 2015). Мы подтвердили, что трансген YAP-S127A экспрессировался во все моменты времени, сравнив иммунореактивность YAP в маточках мышей Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / +} с мышами соответствующего возраста. Контрольные группы однопометников (рис.6 A – F ). Чтобы обойти любую проблему биодоступности, мы культивировали матки из мышей P1 и P9 Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / +} в присутствии 10 мкг / мл доксициклина и EdU в течение 72 часов. Мочеиспускатели мышей P1 содержали в 7 раз больше клеток Sox2 ⁺ EdU ⁺ , чем матки мышей P9 ( p = 0,0277, t ₍₁₃₎ = 2,48, n = 6-9 ; Fig. 6 H – J ), указывая на то, что постнатальные изменения созревания в маточках ограничивают пролиферацию SC в ответ на избыточную экспрессию YAP-S127A как in vivo, и in vitro, .Однако оказалось, что стриолярные SCs, которые расположены в центральной области матки, остаются чувствительными к YAP-S127A даже на P9 (Fig. 6 I ).

Чтобы определить, коррелирует ли возрастное снижение пролиферации со снижением транскрипционной активности YAP-TEAD, мы культивировали ятрицы мышей P1 и P9 с доксициклином в течение 48 часов и измеряли экспрессию генов-мишеней YAP-TEAD с помощью qRT-PCR. . Экспрессия большинства генов-мишеней снижалась с возрастом как в маточках у мышей Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / +} мышей и контрольных однопометников (рис.6 К ). Однако индукция YAP-S127A на P9 все еще приводила к 4-5-кратному увеличению экспрессии генов-мишеней по сравнению с контролем соответствующего возраста (каждый p = 0,0286, n = 4 биологических повтора, Mann- Whitney test), что указывает на то, что транскрипционный ответ остался неизменным. Вместе эти данные подтверждают, что ответная реакция SCs на передачу сигналов YAP-TEAD снижается с возрастом, но не устраняется с помощью P9.

Мы исследовали паттерны экспрессии факторов транскрипции TEAD, чтобы охарактеризовать их возрастные изменения в матке.RNAscope FISH выявил, что TEAD1 широко экспрессируется в P0, P6 и P16 (Fig. 7 A – C ). TEAD2 экспрессировался во всем матке мыши на P0, но экспрессия была ниже на P6 и почти отсутствовала на P16 (Fig. 7 D – F ). Связанное с возрастом подавление TEAD2 коррелирует со снижением транскрипционной активности и пролиферации YAP-TEAD и согласуется с опубликованными RNA-seq (Gnedeva and Hudspeth, 2015). Транскрипты TEAD3 и TEAD4 не обнаружены (данные не показаны). Антитело, специфичное для ядер SC, меченных TEAD1, в матках новорожденных и взрослых мышей (рис.7 G , H ). Иммуноокрашивание маток новорожденных и взрослых мышей показало, что YAP также оставался экспрессированным во взрослых SC (фиг. 7 I , J ), что мы подтвердили на образце человека (фиг. 7 K ). Продолжающаяся экспрессия YAP и TEAD1 у взрослых повышает вероятность того, что SCs в маточках зрелых млекопитающих могут оставаться чувствительными к передаче сигналов YAP-TEAD.

Рисунок 6.

Вход в S-фазу, вызванный сверхэкспрессией YAP-S127A в матке, снизился во время постнатального созревания. AF , Изображения EdU с малым увеличением, показывающие, что вход S-фазы в тележки Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / +} мышей ( DF ) снизился в зависимости от возраста. В качестве контроля использовали матки от однопометников WT, Sox10 ^{rtTA / +} и Yap-S127A ^+/- . На вставках — иммунореактивность YAP в маточках соответствующего возраста. G , Количественная оценка плотности клеток EdU ⁺ выявила возрастное снижение вступления в S-фазу.Двусторонний дисперсионный анализ показал значительные эффекты для генотипа, возраста и взаимосвязи возраст-генотип (все p <0,0001, n = 6-16 мышей на условие). **** p <0,0001 (тесты множественных сравнений Сидака). нс, не значимо ( p > 0,05). H , I , Изображения эксплантированных маток из P1 и P9 с малым увеличением Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / +} в культивируемых мышах доксициклина 10 мкг / мл и EdU в течение 72 часов.Пунктирные линии указывают границу желтого пятна, очерченную иммуноокрашиванием Sox2. J , Количественная оценка клеток Sox2 ⁺ EdU ⁺ показала, что частота входа в S-фазу была значительно ниже в маточках от P9 Yap-S127A ^+/- ; Sox10 ^{rtTA / +} мышей по сравнению с мышами P1 этого генотипа ( p = 0,0277, n = 6-9 матриц). K , qRT-PCR выявила, что экспрессия генов-мишеней YAP-TEAD относительно Gapdh снижалась в зависимости от возраста независимо от генотипа.Сравнения с контролями P1 указаны следующим образом: * p = 0,016; ** p = 0,0095; Тест Манна-Уитни. n = 4-6 биологических повторов. Данные являются средними ± стандартное отклонение.

Рисунок 7. Уровень экспрессии TEAD2

снижался по мере старения мышей, но уровни экспрессии TEAD1 и YAP сохранялись во всей матке. A-F , Мишки мышей P0, P6 и P16 фиксировали, замораживали, делали срезы и исследовали на наличие мРНК с помощью RNAscope. Сообщение TEAD1 было обнаружено по всему телу у всех протестированных возрастов ( A – C ).Сообщение TEAD2 было обнаружено по всему телеграфу в точке P0, но оно уменьшилось в зависимости от возраста ( D-F ). Масштабные линейки, 100 мкм. Белые скобки обозначают стриолярный домен Cyp26b1 ⁺ . Пунктирными линиями обозначена граница между сенсорным эпителием и подлежащей стромой. Вставки, большее увеличение. Масштабные линейки 10 мкм. G – J , маркировка антител TEAD1 и YAP в матках мыши показала широкую экспрессию, которая сохранялась от новорожденных ( G , I ) до взрослых ( H , J J ). ) этапы.Вставки: изображения ядерного слоя СК с большим увеличением ( G , H ) и апикальной поверхности ( I , J ). Масштабные линейки 10 мкм. K , Ортогональный вид матки взрослого человека, иммуноокрашенной на YAP и Myo7a с маркировкой Hoechst ядер клеток.

YAP-5SA запускает TEAD-зависимую пролиферацию в маточках взрослых мышей

YAP-5SA содержит пять мутаций серина в аланин, которые позволяют ему уклоняться от ингибирующего фосфорилирования, которое приводит к цитоплазматической секвестрации и деградации (Zhao et al., 2007, 2009, 2010). Он также более эффективно стимулирует передачу сигналов YAP-TEAD, чем YAP-S127A (Zhao et al., 2009). Мы эксплантировали матриксы мышей P30 и аденовирусно трансдуцировали SC с помощью YAP-5SA. Соответствующие клетки трансдуцировали mCherry в качестве отрицательного контроля или WT YAP для оценки эффекта ингибирующего фосфорилирования. Скорость передачи SC не различалась между вирусами ( p = 0,62, F _(3,12) = 0,61, ANOVA, n = 4 ядра; фиг.8 A ), с ∼ 30% SC и <1% HC трансдуцировались в используемом титре (данные не показаны), что согласуется с предыдущими сообщениями (Burns et al., 2012c). Через 3 дня культивирования в присутствии BrdU в матрицах, трансдуцированных mCherry или WT YAP, в среднем было <2 клеток Sox2 ⁺ BrdU ⁺ (фиг. 8 B – F ). Напротив, матки, трансдуцированные с помощью YAP-5SA, в среднем составили 69 ± 56 ( p <0,0001, F _(3,44) = 15, n = 10-16, ANOVA; фиг. 8 D , F ). В клетках Sox2 ⁺ BrdU ⁺ отсутствовали пучки волос, что позволяет предположить, что они были SC, а не HC типа II (данные не показаны).

Мы измерили отношения N: C YAP в трансдуцированных клетках, которые экспрессировали репортер mCherry. SC, трансдуцированные YAP-5SA, показали значительно более высокие отношения N: C по сравнению с SC, трансдуцированными WT YAP ( p = 0,0446, F _(2,9) = 10,5, n = 4, ANOVA с тестом Тьюки ; Рис. 8 G – J ). Кроме того, антитело, специфичное к фосфо-YAP (S127), сильно метило цитоплазму SC, трансдуцированных WT YAP, но не тех, которые трансдуцированы YAP-5SA, в которых этот эпитоп мутирован (рис.8 К , L ). Эти результаты показывают, что эктопический YAP WT фосфорилируется и удерживается в цитоплазме, тогда как YAP-5SA, у которого отсутствуют сайты ингибирующего фосфорилирования, проникает в ядра SC и способствует переходу в S-фазу.

Чтобы проверить, требуются ли факторы транскрипции TEAD для пролиферации, индуцированной YAP-5SA, мы трансдуцировали матриксы P30 с помощью YAP-5SA / S94A, который содержит мутации серина в аланин YAP-5SA плюс мутацию в остатке 94. который отменяет взаимодействие YAP-TEAD (Zhao et al., 2008). Иммунолокализация показала, что YAP-5SA / S94A был значительно обогащен ядрами SC по сравнению с эктопическим YAP дикого типа ( p = 0,0036, F _(2,9) = 10,5, n = 4, ANOVA с тестом Тьюки; Фиг.8 I , J ), но повторного входа в клеточный цикл не произошло (Фиг.8 E , F ). В совокупности эти результаты подтверждают, что освобождение YAP от ингибирующего фосфорилирования может позволить ему способствовать TEAD-зависимой пролиферации в зрелых стриолярных SCs.

Повторный вход клеточного цикла в ответ на YAP-5SA преимущественно происходил в стриолярной области. В маточках, трансдуцированных YAP-5SA и иммуноокрашенных на BrdU и стриолярный маркер SC Tectb через 5 дней культивирования, плотность клеток BrdU ⁺ была> 3 раза выше в области Tectb ⁺ по сравнению с областью Tectb-. ( p = 0,0001, t ₍₄₎ = 15,3, n = 5, парный тест t ; рис.9). Не было значительной разницы в плотности трансдуцированных SC между стриолярной и латеральной экстрастриолярной областью (латеральная: 83 ± 22; стриолярная: 83 ± 20 SC / 10 000 мкм ² , p = 0.90, t ₍₃₎ = 0,14, n = 4, парный t тест). Мы попытались определить, будут ли пролиферирующие SCs дифференцироваться в HCs, однако конститутивная сверхэкспрессия YAP-5SA нарушает морфологию стриолы в культурах, сохраняющихся через 5 дней или дольше после трансдукции (фиг. 9 A ), что исключает такой анализ.

Фигура 8.

YAP-5SA вошел в ядра SC и стимулировал TEAD-зависимую пролиферацию в матках мыши P30 in vitro .Мочки мышей P30 помещали в культуру и оставляли для акклиматизации в течение ночи. На следующий день аденовирус типа 5 использовали для трансдукции SC с помощью mCherry, WT YAP, YAP-5SA или YAP-5SA / S94A. Мочеиспускания поддерживали в присутствии BrdU в течение дополнительных 3 дней перед обработкой для иммуногистохимии. A , Количественная оценка не выявила существенных различий в скоростях трансдукции вирусов ( p = 0,62, ANOVA, n = 4 пузырька). B – E , Изображения с малым увеличением показали, что трансдукция происходила во всех условиях, но вход в S-фазу происходил исключительно в маточках, трансдуцированных с помощью YAP-5SA ( B′ – E ′ ).Изображения высокого разрешения ядерного слоя SC, показывающие экспрессию репортера mCherry ( B ″ –E ″ ), а также Sox2 и BrdU ( B ′ ″ — E ′ ″ ). Ядра BrdU ⁺ в матрицах трансдуцировались YAP-5SA, меченным SC маркером Sox2 ( D ‘″ ), и появлялись с более низкой плотностью, возможно, из-за межкинетической миграции ядер или морфологического нарушения. F , Количественное определение клеток Sox2 ⁺ BrdU ⁺ на матку через 3 дня культивирования.Вход в S-фазу значительно увеличивался в маточках, обработанных YAP-5SA ( p <0,0001, ANOVA, n = 10-16 матриксов). G , H , Изображения с большим увеличением ядерного слоя мочеиспускательного канала SC, преобразованные с помощью WT YAP, YAP-5SA и YAP-5SA / S94A и проанализированные через 72 часа после трансдукции. WT YAP был относительно обогащен в цитоплазматическом пространстве, окружающем ядра SC ( G ″ ), тогда как YAP-5SA и YAP-5SA / S94A были относительно обогащены ядрами SC ( H ″ , I ″ ). J , Среднее соотношение YAP N: C в маточках, трансдуцированных с помощью WT YAP (0,66 ± 0,07, среднее ± стандартное отклонение), было значительно ниже, чем у трансдуцированных с помощью YAP-5SA (0,85 ± 0,12, p = 0,0446) или YAP-5SA / S94A (0,97 ± 0,09, p = 0,0036, ANOVA с множественными сравнениями Тьюки, n = 4 контейнера). K , L , Изображения с большим увеличением SC ядерного слоя маток мышей P30, трансдуцированных WT YAP и проанализированных через 72 часа после трансдукции.Клетки, положительные по репортеру mCherry, также были помечены антителом, специфичным для YAP, который фосфорилируется по серину 127 ( K ). SC, трансдуцированные YAP-5SA, который имеет мутацию из серина в аланин по серину 127, служили отрицательным контролем специфичности антитела ( L ). Данные являются средними ± стандартное отклонение. нс p > 0,05, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001.

Рисунок 9.

Повторный вход в клеточный цикл, вызванный YAP-5SA, происходил избирательно в стриолярных СК. Мочеиспускания мышей P30 трансдуцировали YAP-5SA после периода акклиматизации в течение ночи и культивировали в течение дополнительных 5 дней с BrdU перед обработкой для иммуногистохимии. A , Большая часть вступления S-фазы произошла в стриолярной области Tectb ⁺ . B , Количественная оценка плотности клеток BrdU ⁺ показала, что пролиферирующих клеток было значительно больше в стриолярной области Tectb ⁺ , чем в экстрастриоле ( p = 0.0001, парный тест t , n = 5 бутылок). График представляет индивидуальные значения для каждой упаковки. *** р <0,001.

Условный KO LATS1 и LATS2 стимулирует пролиферацию в постнатальных маточках мышей

LATS1 и LATS2 являются основными киназами, которые опосредуют ингибирующее фосфорилирование YAP по мотивам HXRXXS, тем самым регулируя его локализацию и стабильность (Zhao et al., 2007). Мы обнаружили иммунореактивность фосфо-YAP (S127), показатель активности киназы LATS (Zhao et al., 2007), в SCs во всех маточках новорожденных и взрослых мышей (Fig. 10 A , B ), поэтому мы предположили, что инактивация LATS1 / 2 будет приводить к повторному вхождению клеточного цикла в послеродовой матке мышей. Мы использовали подход in vitro , чтобы проверить это, поскольку у мышей Lats1 ^{flox / flox} ; Lats2 ^{flox / flox} ; Plp1-Cre ^ERT2 у мышей развивались опухоли даже в отсутствие введения тамоксифена. Для этого мы эксплантировали клетки мышей Lats1 ^{flox / flox} ; Lats2 ^{flox / flox} и аденовирусно трансдуцировали их SC с помощью mCherry или mCherry-T2A-Cre (LATS1 / 2 cKO).Мочки культивировали в течение 7 дней с добавлением EdU на последние 2 дня для маркировки SC, которые вошли в S-фазу. В маточках от мышей P30 иммунореактивность фосфо-YAP (S127) была снижена в маточках Lats1 ^{flox / flox} ; Lats2 ^{flox / flox} , трансдуцированных mCherry-T2A-Cre по сравнению с соседними нетрансдуцированными SC и SC. трансдуцированные одним mCherry (фиг. 10 C , D ), что указывает на то, что LATS1 / 2 экспрессируются в зрелых SC и опосредуют непрерывное ингибирующее фосфорилирование YAP.

Мыши от P1 Lats1 ^{flox / flox} ; Lats2 ^{flox / flox} мышей, трансдуцированных mCherry-T2A-Cre, в среднем имели в 38 раз больше SCs EdU ⁺ , чем контрольные (240 ± 145 против 6 ± 3). , p = 0,018, t ₍₆₎ = 3,2, n = 4; рис. 10 E – G ), с некоторыми ядрами EdU ⁺ , видимыми в виде митотических фигур (рис. 10F ′ ′ ′). В пузырях P30 делеция LATS1 / 2 значительно увеличивает вход в S-фазу, хотя и в меньшей степени, чем в P1.После 7 DIV в матрицах LATS1 / 2 cKO в среднем было 12 ± 15 клеток EdU ⁺ , что в 4,4 раза больше, чем в контроле P30 ( p = 0,0342, t ₍₂₈₎ = 2,73, n = 15) . Увеличение продолжительности культивирования до 11 дней привело к образованию 17 ± 21 клеток EdU ⁺ в матрицах LATS1 / 2 cKO, что в 9 раз больше по сравнению с контролем ( p = 0,0393, t ₍₁₈₎ = 2,22, n = 10; рис. 10 H – J ). Плотность трансдуцированных СК существенно не различалась между матриклами Р1 и Р30 (Р1: 62 ± 15; Р30: 53 ± 27 СК / 10 000 мкм ² ; p = 0.60, t ₍₅₎ = 0,56, n = 3 или 4). Как в утрикулах LATS1 / 2 cKO P1 и P30, пролиферирующие SCs располагались в стриолярном распределении (Fig. 10 E , F ). Т.о., LATS1 / 2 необходимы для поддержания покоя в основной субпопуляции зрелых SCs млекопитающих.

Фигура 10.

Делеция LATS1 и LATS2 снижает ингибирующее фосфорилирование YAP и индуцирует пролиферацию SC в маточках новорожденных и взрослых мышей. A , B , Мишки мышей P0 и P30 иммуно метили на фосфо-YAP (S127), показатель активности киназы LATS1 / 2.Иммунореактивность фосфо-YAP обнаруживалась в SC в стриолярной и латеральной областях как на P0, так и на P30. Пунктирная желтая линия указывает линию смены полярности, разделяющую боковые экстрастриолярные и стриолярные области. C , D , Изображение апикальной поверхности маток с большим увеличением из P30 Lats1 ^{flox / flox} ; Lats2 ^{flox / flox} мышей, трансдуцированных с помощью mCherry (Control) или mA2 -Cre (LATS1 / 2 cKO) и культивировали в течение 11 дней.SCs, которые экспрессировали только репортер mCherry, проявляли аналогичные уровни иммунореактивности фосфо-YAP (S127) по сравнению с соседними SC, которые не были трансдуцированы ( C ). Уровни фосфо-YAP (S127) были ниже в SC, которые экспрессировали Cre, что позволяет предположить, что произошла делеция LATS1 и LATS2 ( D ). E , F , Мочеиспускания были эксплантированы от мышей Lats1 ^{flox / flox} ; Lats2 ^{flox / flox} на P1 и трансдуцированы с помощью mCherry (контроль) или mCherry-LATS1 / Crery-T2 2 cKO) и культивировали в течение 7 дней.EdU добавляли в течение последних 2 дней культивирования для отслеживания клеток, которые вошли в S-фазу. Немногочисленные клетки EdU ⁺ присутствовали в контрольных маточках ( E , E ‘ ), но значительное количество клеток было обнаружено в центральной области LATS1 / 2 cKO ( F , ). F ′ ). На изображениях с большим увеличением SC-слоя ( E ″ , F ″ ) показаны ядра EdU ⁺ и митотическая фигура (стрелка) в матке LATS1 / 2 cKO ( F ″ ). G , Количественная оценка клеток EdU ⁺ в контроле P1 и матрицах LATS1 / 2 cKO показывает, что LATS1 / 2 cKO значительно увеличивает вход в S-фазу по сравнению с контролями ( p = 0,018, n = 4 пузырька) . H , I , Мочеиспускания были эксплантированы от мышей Lats1 ^{flox / flox} ; Lats2 ^{flox / flox} на P30 и трансдуцированы с помощью mCherry (контроль) или mCherry-LATS-LATS-T2 (контроль) или mCherry-T2 2 cKO) и культивировали в течение 11 дней.EdU добавляли на последние 2 дня культивирования. Контрольные матки содержали небольшое количество клеток EdU ⁺ ( H , H ‘ ), и значительно больше клеток EdU ⁺ наблюдалось в стриолярном распределении LATS1 / 2 cKO utricles ( I ). , I ′ ). J . Количественная оценка показывает значительно увеличенное количество клеток EdU ⁺ в матрицах cKO P30 LATS1 / 2 по сравнению с контролем ( p = 0.0393, n = 10 бутылок). Пунктирными линиями обозначена граница желтого пятна. Данные являются средними ± стандартное отклонение. * р <0,05.

Обсуждение

Возникающая парадигма эпителиальной репарации определяет, что при повреждении YAP накапливается в ядрах растянутых клеток, где он способствует пролиферации с помощью факторов транскрипции TEAD (Guillot and Lecuit, 2013; Benham-Pyle et al., 2015; Irvine and Шрайман, 2017). Мы обнаружили, что YAP легко накапливается в ядрах SC матрикса курицы в ответ на ототоксическое и механическое воздействие, но в соответствии с видовыми различиями в регенеративной пролиферации локализация YAP была менее чувствительна к изменению формы и острому ингибированию MST1 / 2 в SC мыши, чем в SCs мыши. куриные SC.Сверхэкспрессия варианта YAP-S127A, который может проникать в ядра, вызывает транскрипционную активность YAP-TEAD и пролиферацию SC в матке новорожденных мышей. Этот пролиферативный ответ снижался с возрастом, но до некоторой степени сохранялся в зрелых SC. Эктопический YAP WT фосфорилировался и секвестрировался в цитоплазме, но вариант YAP-5SA, у которого отсутствуют сайты фосфорилирования LATS1 / 2, проникал в ядра зрелых SC и приводил к TEAD-зависимой пролиферации в стриоле. Подтверждая важность ингибирующего фосфорилирования, делеция LATS1 / 2 снижает фосфо-YAP и вызывает пролиферацию стриолярных SCs даже в маточках взрослых мышей.Результаты показывают, что конститутивная передача сигналов с помощью киназ LATS1 / 2 необходима для фосфорилирования YAP и удержания SCs в маточках мыши в постоянном состоянии покоя. Ингибирующий путь Hippo активен в SC неповрежденной куриной матки, но инактивируется или обходится при потере HC. В целом, эти находки обеспечивают новую механистическую основу для объяснения того, почему млекопитающие и немлекопитающие различаются по своей способности заменять сенсорные HCs, и демонстрируют, что реактивация передачи сигналов YAP-TEAD может быть достаточной для индукции пролиферации SC в балансном эпителии млекопитающих.

Точный механизм, с помощью которого потеря HC приводит к активации YAP в куриных SC, еще предстоит выяснить. У кур потеря HC приводит к быстрому расширению соседних поверхностей SC (Cotanche, 1987), и мы обнаружили, что изменения формы коррелируют со степенью накопления ядер YAP (Fig. 2). Эти изменения формы могут нарушить каскад киназ MST1 / 2-LATS1 / 2, позволяя YAP накапливаться в ядре. Изменения формы, по-видимому, модулируют MST1 / 2 в определенных эпителиях (Varelas et al., 2010; Fletcher et al., 2018), но не другие (Kim et al., 2011; Codelia et al., 2014; Meng et al., 2015), а некоторые формы механической регуляции YAP не требуют ни MST1 / 2, ни LATS1 / 2 (Dupont et al. ., 2011; Арагона и др., 2013). Поскольку межклеточные соединения сильно регулируют передачу сигналов от гиппопотама (Karaman and Halder, 2018), потеря HC может вызвать ядерное накопление YAP в SC рыб и амфибий, чьи соединения похожи на SCs птиц в том, что они содержат мало E-кадгерина и имеют тонкую периферическую поверхность. Полосы F-актина (Burns et al., 2008, 2013).

Стрептомицин-индуцированная потеря HC не влияла на локализацию YAP в мышиных SC (рис. 1). SCs мышей д. Претерпевать более значительные изменения формы, чем их птичьи аналоги, чтобы увеличить вероятность перехода в S-фазу (Collado et al., 2011a). Это соответствует нашим наблюдениям, что деформации SC вызывают накопление ядер YAP в SCs млекопитающих, но в меньшей степени, чем в SCs кур (Fig. 2). Таким образом, изменения формы, вызванные потерей HC в матке мыши, могут быть ниже порогового значения, вызывающего накопление YAP в ядре, а дополнительные тормозящие сигналы могут ограничивать доступ YAP к ядру.

В отличие от куриных SC, острое ингибирование MST1 / 2 не влияло на локализацию YAP в мышиных SC (рис. 3). Это указывает на то, что независимые от MST1 / 2 механизмы могут активировать LATS1 / 2 в SCs мыши. Сообщается, что E-кадгерин активирует LATS1 / 2 независимо от MST1 / 2 в других эпителиях (Kim et al., 2011) и экспрессируется на гораздо более высоких уровнях в SC млекопитающих, чем у птиц, рыб и амфибий (Collado et al., 2011). ., 2011б; Burns et al., 2013). Фармакологические методы лечения, которые истощают E-кадгерин из стриолярных соединений SC, также влияют на экспрессию YAP и вызывают пролиферацию SC (Kozlowski et al., 2020). Здесь сверхэкспрессия YAP-S127A в SCs млекопитающих индуцирует повышенную регуляцию E-cadherin, что может отражать отрицательную обратную связь (Fig. 5 A – D ). Киназы MAP4K и метаболические изменения также могут активировать LATS1 / 2 независимо от MST1 / 2 (Meng et al., 2015; Wang et al., 2015b; Nokin et al., 2016). Точное определение того, какие восходящие сигналы активируют LATS1 / 2 в SCs млекопитающих, будет способствовать усилиям по преодолению пролиферативного покоя.

Поскольку делеция LATS1 / 2 снижает ингибирующее фосфорилирование YAP и воспроизводит паттерн TEAD-зависимой стриолярной пролиферации, вызываемой сверхэкспрессией YAP-5SA, наши данные убедительно подтверждают, что LATS1 / 2 поддерживает пролиферативное покой за счет ограничения передачи сигналов YAP-TEAD.Подтверждая это мнение, недавний отчет показал, что фармакологическое ингибирование активности киназы LATS1 / 2 вызывает YAP-зависимую пролиферацию в маточках зрелых мышей (Kastan et al., 2020). Однако эти данные не исключают вклада YAP-независимых механизмов ниже инактивации LATS1 / 2, таких как разборка репрессивного комплекса DREAM (Tschöp et al., 2011).

LATS1 и LATS2 имеют перекрывающиеся функции и наиболее заметно различаются по профилям экспрессии (Furth and Aylon, 2017).Эти результаты не различают, требуется ли одна или обе киназы для поддержания покоя SC. Точно так же YAP и его паралог TAZ имеют в значительной степени перекрывающиеся функции (Plouffe et al., 2018). Хотя мы исследовали локализацию и фосфорилирование YAP, повреждение и делеция LATS1 / 2 могут аналогичным образом влиять на TAZ.

Сверхэкспрессия YAP-S127A достаточна для стимуляции широко распространенной пролиферации и увеличения плотности клеток в матке мышей P1 (рис. 4, 5), что согласуется с моделью, в которой инактивация передачи сигналов YAP-TEAD, зависящая от плотности клеток, опосредует клеточный цикл. остановка в развивающейся матке (Гнедева и др., 2017). Однако, поскольку плотность клеток на плато матки мышей около E17.5 (Gnedeva et al., 2017), модель не учитывает постнатальное снижение способности SCs преодолевать пролиферативное покой (Burns et al., 2012a). Поскольку это возрастное снижение происходит, несмотря на сверхэкспрессию YAP-S127A или делецию LATS1 / 2, данные показывают, что пролиферация SC дополнительно ограничивается возрастными изменениями, лежащими ниже ингибирующего фосфорилирования YAP, такими как подавление TEAD2 или изменения в параллельных путях, таких как каноническая передача сигналов Wnt, передача сигналов Notch, экспрессия Atoh2 и экспрессия SoxC (Gnedeva and Hudspeth, 2015; Maass et al., 2015; Wang et al., 2015a; Самараджива и др., 2018; Сайид и др., 2019).

Похоже, что множественные уровни регуляции способствуют покою SC, хотя и не одинаково для всех эпителий HC. Напр., Хроматин менее доступен в SCs улитки, чем в утрикулярных SCs (Jen et al., 2019), и стриолярные SCs более склонны к пролиферации, чем экстрастриолярные SCs, когда ингибирующее фосфорилирование YAP обходится (Figs. 6, 8-10). Скорости пролиферации стриолярных и экстрастриолярных СК незначительно варьировались между in vivo, и in vitro, экспериментами (рис.4 F , 6), возможно, из-за биодоступности доксициклина или условий культивирования. Постепенное ограничение входа S-фазы в стриолярную область матки после избыточной экспрессии YAP-S127A in vivo, и in vitro, (фиг. 6) указывает на то, что различия между стриолярно-экстрастриолярными элементами расширяются на протяжении всего постнатального созревания. Низкая скорость экстрастриолярной пролиферации в утрилах cKO P1 LATS1 / 2 может быть связана со старением эксплантата во время процессов аденовирусной трансдукции, экспрессии Cre, рекомбинации аллелей LATS1 / 2 и деградации уже существующих мРНК и белка LATS1 / 2 (рис. .10 E – G ). Вероятность накопления YAP в ядрах стриолярных СК не выше, чем в экстрастриолярных СК после повреждения стрептомицином (рис. 1) или ингибирования MST1 / 2 (рис. 3), предполагая, что факторы, расположенные ниже ядерной аккумуляции YAP или параллельные пути, объясняют разная отзывчивость. Хотя экспрессия TEAD1 и TEAD2 не различалась между стриолярными и экстрастриолярными СК (рис.7), их транскрипционная активность может быть однозначно ограничена в экстрастриолярных СК (Chang et al., 2018). Кроме того, в экстрастриолярных SC могут отсутствовать сигналы, которые способствуют пролиферации ниже передачи сигналов YAP-TEAD: сообщается, что Wnt контролирует пролиферацию ниже YAP в органоидах, происходящих из предшественников улитки, которые экспрессируют Lgr5 ⁺ (Xia et al., 2020), и стриолярных SC. , которые экспрессируют Lgr5 ⁺ , более чувствительны к Wnt, чем экстрастриолярные СК (Lin et al., 2015; Wang et al., 2015a; You et al., 2018). Передача сигналов рецептора ретиноевой кислоты повышена в развивающейся экстрастриоле (Ono et al., 2020) и может ограничивать там пролиферацию, что согласуется с его ролью в обеспечении выхода из клеточного цикла и дифференцировки нейральных предшественников (Janesick et al., 2015).

Регенеративная пролиферация необходима для митотической замены HCs и пополнения пула SC после прямой трансдифференцировки. Остается неясным, почему SCs у позвоночных, не являющихся млекопитающими, легко пролиферируют после потери HC, а у млекопитающих — нет (Forge et al., 1993; Warchol et al., 1993; Golub et al., 2012; Bucks et al., 2017; Senn et al., 2019). Наши результаты раскрывают различия в регулировании YAP, которые могут способствовать этому различию. В то время как YAP необходим для регенеративной пролиферации в матке цыпленка, SCs млекопитающих, по-видимому, регулируют YAP с помощью другого механизма, который до сих пор нечувствителен к потере HC и может быть связан с постнатальным усилением межклеточных соединений, которое происходит исключительно в SCs млекопитающих (Burns et al. al., 2008, 2013; Collado et al., 2011b). Мы обнаружили, что покой SCs у зрелых млекопитающих поддерживается частично за счет конститутивной активности киназ LATS1 / 2, которые фосфорилируют YAP и ограничивают его способность регулировать экспрессию генов с помощью TEAD.Подходы к ингибированию активности киназы LATS1 / 2 в конечном итоге могут быть использованы для содействия замещению утраченных HCs для лечения потери слуха и нарушений равновесия.